姚勝忠 謝 莎 肖燕子 閉水清 謝小薰 肖紹文

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧530021)

癌-睪丸抗原(Cancer-Testis Antigen，CTA)是一類廣譜的腫瘤特異性抗原。CTA能在多種腫瘤組織中廣泛表達(dá)，而在正常組織(除胎盤和睪丸)中幾乎不表達(dá)，并且在一些腫瘤患者體內(nèi)可引起免疫反應(yīng)?；谶@些特性，CTA已成為腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)靶抗原之一，其中一些 CTA如 MAGEA3、NY-ESO-1已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并在一些腫瘤的治療中收到較好的療效［1，2］。黑色素瘤相關(guān)抗原(Melanoma-associated Antigen，MAGE)是CTA家族的重要成員，迄今為止，已鑒定出MAGE家族多個亞家族，其中MAGE-A亞家族包含13個高度同源的基因，依次命名為MAGEA1—A12;MAGE家族成員最大特征是其氨基酸序列存在一個MAGE同源結(jié)構(gòu)域 (MAGE Homology Domain，MHD)。MAGEA2是MAGE-A亞家族的重要成員之一，研究人員對其潛在功能的研究以及其在臨床中的應(yīng)用不斷深入，現(xiàn)就MAGE-A2基因、mRNA的表達(dá)、免疫原性、表達(dá)機(jī)理和生物學(xué)功能方面進(jìn)行綜述。

1MAGE-A2基因結(jié)構(gòu)

MAGE-A2 又稱為 MAGE2，MGC131923，根據(jù)MAGE-A2在CTA家族中的排名又命名為CT1.2(http://www.CTA.lncc.br/)。De等［3］于 1994 年通過T細(xì)胞抗原表位克隆的方法從人類黑色素細(xì)胞中分離并鑒定出MAGE-A2，mage-a2基因定位于染色體 Xq28，基因全長3 977 bp，mRNA長1 979 bp，包含3個外顯子，開放閱讀框位于第3個外顯子，編碼蛋白由314個氨基酸組成。

2MAGE-A2表達(dá)

研究人員通過RT-PCR和寡核苷酸微矩陣技術(shù)，對成年人各種正常組織及20周以上胚胎組織進(jìn)行檢測，除睪丸、胎兒及成人角蛋白細(xì)胞外，均未能檢測到 MAGE-A2 mRNA［3-7］，這表明 MAGE-A2 mRNA在正常組織中的表達(dá)具有明顯的限制性。

MAGE-A2 mRNA分別在多種組織類型腫瘤中存在表達(dá)。由于MAGE-A2是在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，因此研究人員檢測了大量黑色素瘤組織樣品，證實(shí)了MAGE-A2 mRNA在黑色素瘤中的高表達(dá)，但在轉(zhuǎn)移瘤和原位瘤中MAGE-A2 mRNA表達(dá)有一定差異，轉(zhuǎn)移瘤表達(dá)率為70%(101/145)，而原位瘤表達(dá)率為41%(41/100)，在良性黑素細(xì)胞痣及發(fā)育異常痣中均未檢測到 MAGE-A2 mRNA［8-12］。在腦腫瘤中，MAGE-A2 mRNA尤其以小兒腦瘤中表達(dá)多見，如在小兒室管膜瘤(8/14，57%)、小兒多形性惡性膠質(zhì)瘤(1/9，11%)、小兒成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(9/15，60%)，其在成人多形性惡性膠質(zhì)瘤(1/20，5%)亦有表達(dá)［13，14］。MAGE-A2 mRNA 在肝癌中的表達(dá)有一定特點(diǎn)，在分化良好的肝癌組織中不表達(dá)，而在低分化及中等分化肝癌組織中有表達(dá)［15，16］。另外，在各種類型肺癌中均能檢測到MAGE-A2 mRNA，如腺癌(4/35，11%)、鱗癌(3/14，21%)、小細(xì)胞癌(2/3，67%)及非小細(xì)胞肺癌(13/46，28%)［17，18］。此外，在漿液性卵巢腺癌(4/19，21%)，卵黃囊瘤(?，25%)和骨肉瘤(23/28，82%)中也檢測到MAGEA2 mRNA［19，20］。

除了腫瘤的臨床標(biāo)本外，在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、黑色素瘤干細(xì)胞、畸胎瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、前列腺癌、橫狀肌肉瘤、甲狀腺癌等多種細(xì)胞株也檢測到MAGE-A2 mRNA［4，5，21-28］。

3MAGE-A2的免疫原性

目前已有報道MAGE-A2引起細(xì)胞免疫［29］，以下為已鑒定出的MAGE-A2抗原表位。

MAGE-A2蛋白在細(xì)胞漿內(nèi)可被降解為短肽(多為九肽或十肽)，在與HLA分子結(jié)合后，被遞呈至細(xì)胞膜上為 CTL所識別，并誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答［30-34］。Akiyama 等［35］聯(lián)合 MAGE-A2157-166肽段與其他黑色素瘤相關(guān)抗原肽段如MAGE-1、3制備多重黑素瘤相關(guān)抗原負(fù)載的DC疫苗，在9位轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者腹股溝皮下進(jìn)行注射。除短暫的肝臟異常外，該疫苗對患者無明顯全身反應(yīng);9位患者中有6位患者可檢測到超過2種黑色素瘤相關(guān)抗原的CTL，而患者1和6展示了顯著的腫瘤退化現(xiàn)象，尤其在患者1體內(nèi)，肺黑色素瘤出現(xiàn)明顯退化。與注射疫苗前相比，5個患者體內(nèi)Th1比例更高，3個患者對于復(fù)合疫苗顯示出明顯的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。最后，研究組對疫苗注射后的患者臨床反應(yīng)進(jìn)行檢測，分別從PD(Progressive disease，疾病進(jìn)展)、SD(Stable disease，疾病穩(wěn)定)、PR(Partial response，部分緩解)、CR(Complete response，完全緩解)方面進(jìn)行觀察，在患者1體內(nèi)，黑色素瘤在肺癌中的轉(zhuǎn)移灶及肺門淋巴結(jié)尺寸明顯減小，并且隨著疫苗注射肺門淋巴結(jié)最后幾乎完全消失。注射疫苗后，患者1、2、6有明顯的CTL應(yīng)答反應(yīng)，且伴隨明顯的CTL增加，而患者4、5、7無CTL應(yīng)答反應(yīng)，且除患者7外其他均無明顯的CTL增加。上述研究顯示出負(fù)載DC的黑色素瘤復(fù)合疫苗確實(shí)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤體內(nèi)有一定作用，且其臨床反應(yīng)也顯示出較強(qiáng)的抑制作用，但在所選的患者中，出現(xiàn)明顯異質(zhì)性，這可能與患者個體異質(zhì)性有關(guān)，目前還不清楚其具體機(jī)制。

4MAGE-A2的表達(dá)機(jī)理

表1 MAGE-A2抗原表位Tab．1 MAGE-A2 Epitopes

Shichijo等［36］首先發(fā)現(xiàn)通過甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC(5-Aza-CdR)，可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞性白血病的腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞系(經(jīng)植物血凝素/白細(xì)胞介素-2刺激)和B細(xì)胞系(EB病毒感染)表達(dá)MAGE-A2。隨后，Sigalotti等［37］分析56名皮膚黑色素瘤患者腫瘤組織中MAGE-A2的表達(dá)與其啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MAGE-A2陽性的腫瘤組織中，其啟動子區(qū)域?yàn)榉羌谆癄顟B(tài)，而在MAGE-A2陰性的腫瘤組織中，其啟動子區(qū)域?yàn)榧谆?。用DAC處理MAGE-A2陰性的黑色素瘤細(xì)胞株后，可誘導(dǎo)MAGE-A2表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證甲基化對MAGEA2表達(dá)調(diào)控，他們還構(gòu)建MAGE-A2啟動子的報告基因質(zhì)粒，將該質(zhì)粒進(jìn)行甲基化處理后，分別將經(jīng)甲基化處理和未經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑色素瘤細(xì)胞株中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒顯示報告基因活性，這說明了啟動子甲基化對于MAGE-A2的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用。Takahito等［28］發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)MAGE-A2的前列腺癌細(xì)胞株中，用DAC處理可上調(diào)MAGE-A2表達(dá)。另一研究報道也顯示用DAC處理后的白血病、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞株，MAGE-A2表達(dá)明顯上調(diào)，而這種現(xiàn)象僅發(fā)現(xiàn)在MAGE-A2低表達(dá)的細(xì)胞株［38］;另外，該研究還發(fā)現(xiàn)乙?；D(zhuǎn)移酶TSA(Trichostatin A，曲古抑菌素A)能協(xié)同DAC上調(diào)MAGE-A2表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用DAC和TSA處理細(xì)胞株可使MAGE-A2上調(diào)率更高，而單獨(dú)使用TSA僅微弱上調(diào)MAGE-A2的表達(dá);為了功能性地檢測DNA去甲基化和組蛋白乙?；瘜幼踊钚缘挠绊?，進(jìn)一步通過構(gòu)建含報告基因的MAGE-A2啟動子質(zhì)粒，將其甲基化處理后，分別將經(jīng)甲基化處理和未經(jīng)甲基化處理的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不表達(dá)MAGE-A2的乳腺癌細(xì)胞MCF-7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與非甲基化質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染甲基化質(zhì)粒的組別其啟動子活性下降明顯，然而，轉(zhuǎn)染甲基化質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)TSA處理后，啟動子活性上升，而轉(zhuǎn)染非甲基化質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)TSA處理后，啟動子活性上升明顯，這些結(jié)果說明MAGE-A2的轉(zhuǎn)錄不但受甲基化的調(diào)控，而且也與乙酰化有關(guān)。然而，在表達(dá)MAGE-A2的卵巢癌細(xì)胞株中，DAC處理細(xì)胞卻下調(diào)MAGE-A2表達(dá)，這可能與不同細(xì)胞對DAC的反應(yīng)不同有關(guān)［39］。

甲基化CpG結(jié)合域蛋白(Methyl-CpG binding domain proteins，MBD)是一類結(jié)合在甲基化的CpG位點(diǎn)起轉(zhuǎn)錄抑制作用的蛋白，為了深入探討甲基化對 MAGE-A2 表達(dá)的調(diào)控，Wischnewski等［40］研究了目前較熱門的幾種 MBD，如 MBD1、MBD2a和MeCP2，電泳遷移率檢測結(jié)果顯示MBD1與甲基化和非甲基化的MAGE-A2啟動子都有親和力，而使用針對MBD1和MeCP2的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)后，結(jié)果顯示MAGE-A2基因表達(dá)上調(diào)，而 MeCP2對MAGE-A2親和力更高，這表明MBD1和MeCP2可抑制MAGE-A2啟動子活性。另外，體外構(gòu)建甲基化及非甲基化的MAGE-A2啟動子質(zhì)粒，與MBD1共同轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株和MBD1缺失的小鼠細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這兩種細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染甲基化MAGE-A2啟動子質(zhì)粒的組別，MAGE-A2啟動子活性幾乎全部消失，而轉(zhuǎn)染非甲基化MAGE-A2啟動子質(zhì)粒的組別MAGE-A2啟動子活性有下降，說明MBD1可抑制MAGE-A2表達(dá)，然而對MBD2a及MeCP2進(jìn)行同樣研究，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)MBD2a可上調(diào)MAGE-A2啟動子活性，而MeCP2對MAGE-A2啟動子活性并無影響。上述結(jié)果顯示甲基化抑制MAGE-A2表達(dá)機(jī)理是涉及多種MBD的共同作用。

5MAGE-A2的生物學(xué)功能

對MAGE-A2的生物學(xué)功能研究表明，MAGEA2可抵抗多種腫瘤藥物的作用。Duan等［41］將MAGE-A2轉(zhuǎn)入紫杉醇敏感的人卵巢癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的抗紫杉醇及抗阿霉素作用，表現(xiàn)出顯著的生長優(yōu)勢。另外，通過siRNA敲除雄激素敏感的前列腺癌細(xì)胞株LNCaP中MAGEA2表達(dá)，隨后用一種類紫杉醇藥物多西他奇(Docetaxel)處理細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與敲除MAGE-A2前的細(xì)胞株相比，敲除后的細(xì)胞株生存率明顯下降，進(jìn)一步佐證MAGE-A2所致的細(xì)胞抗耐藥性［28］。還有研究發(fā)現(xiàn)MAGE-A2與抑癌基因p53的結(jié)合，可募集組蛋白去乙酰化酶至p53的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)達(dá)到抑制p53轉(zhuǎn)錄的作用;同時，通過DAC上調(diào)MAGE-A2表達(dá)后，黑色素瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物依托泊甙的抗藥性增加，這種抗藥性的改變是依賴于p53活性改變而隨之改變;將原來高表達(dá)MAGE-A2的黑色素瘤細(xì)胞，通過siRNA下調(diào)其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53活性恢復(fù)，腫瘤細(xì)胞的抗藥性也隨之恢復(fù)，從而驗(yàn)證了MAGE-A2通過組蛋白乙?；赣绊憄53活性而從達(dá)到抗腫瘤藥的功效［42］。有研究發(fā)現(xiàn)沉默前列腺癌細(xì)胞株中MAGE-A2表達(dá)，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，提示MAGE-A2可能在前列腺癌進(jìn)展過程中起到重要作用，其機(jī)制尚不清楚;另外，該研究還發(fā)現(xiàn)MAGE-A2在去勢治療無效的前列腺癌患者中呈高表達(dá)，由于去勢的目的是消除雄激素作用，因此對MAGE-A2表達(dá)與雄激素之間關(guān)系進(jìn)行探討，使用含雄激素的培養(yǎng)液培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株LNCaP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常規(guī)培養(yǎng)的LNCaP細(xì)胞相比，前者細(xì)胞中MAGE-A2表達(dá)未改變，這顯示這雄激素并未涉及MAGE-A2 表達(dá)［26］。

6 小結(jié)

MAGE-A2的特異性表達(dá)模式，使其成為腫瘤免疫治療的理想靶抗原。MAGE-A2引發(fā)的主要是細(xì)胞免疫，在MAGE-A2蛋白分子中，目前已知3個MHC I類分子限制性表位及1個MHC II類分子限制性表位。MAGE-A2聯(lián)合其他黑色素瘤相關(guān)抗原制備多重黑素瘤相關(guān)抗原負(fù)載的DC疫苗在黑色素瘤轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，患者體內(nèi)腫瘤病灶及轉(zhuǎn)移灶尺寸明顯減小，顯示出復(fù)合疫苗強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。MAGE-A2的表達(dá)與其啟動子區(qū)域的甲基化及組蛋白乙酰化酶的活性有關(guān)，了解了這個表達(dá)機(jī)理，將有助于我們應(yīng)用去甲基化藥物或組蛋白乙酰化酶上調(diào)MAGE-A2表達(dá)，使其更有效應(yīng)用于腫瘤免疫治療。近年來的研究表明MAGEA2與腫瘤藥物耐藥性有關(guān)，其耐藥性產(chǎn)生是通過影響p53活性實(shí)現(xiàn)的。且MAGE-A2可能在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中其重要作用。目前對其生物學(xué)功能研究較少，相信通過對MAGE-A2生物學(xué)功能的探討，將有助于我們認(rèn)識腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程。

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