胡曉波 朱乃碩

(復旦大學生命科學學院分子免疫實驗室 遺傳工程國家重點實驗室 生物醫(yī)學研究院，上海200433)

狂犬病是一種由狂犬病毒引起的、危害極大的致命傳染病。中國是狂犬病嚴重流行的國家之一，每年因狂犬病而死亡的人數高達3000人左右，位居世界第二［1-3］。疫苗是當前防治狂犬病的唯一途徑，然而現有的狂犬疫苗存在免疫程序復雜、細胞免疫反應較弱等嚴重缺陷，無法保證在病毒潛伏期內產生較高的保護力，不利于狂犬病的防治工作。有研究表明T細胞產生的CTL與Th免疫應答反應在抗狂犬病毒感染時發(fā)揮了重要作用［4-6］，因此篩選鑒定出相關的CTL與Th表位，并由此開發(fā)出具有高效預防或治療性作用的表位疫苗對防治狂犬病工作有重要的意義，但迄今為止，僅報道了少數幾個狂犬病毒的 CTL 與 Th 表位［4，7-9］。

隨著生物信息學的迅速發(fā)展，計算機軟件預測表位的方法和精確度有了很大的改善［10-12］。在狂犬病毒的四種蛋白中，糖蛋白(G蛋白)與核蛋白(N蛋白)是兩種誘導細胞免疫與體液免疫的重要蛋白，因此本研究采用生物信息學軟件 BIMAS［13］、RANKPEP［14］和 SYFPEITHI［11］對 G 蛋白及 N 蛋白的CTL與Th表位進行預測，并以淋巴細胞增殖試驗、ELISPOT以及流式細胞法對獲得的表位進行鑒定，初步獲得2條BALB/c小鼠MHC限制性CTL和Th表位，為下一步開發(fā)狂犬病毒的表位疫苗提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 BALB/c小鼠24只，雌性，6～8周齡，25～30 g/只，購自中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1．2 實驗材料 人用狂犬病疫苗(Vero細胞)購自遼寧成大生物股份有限公司(生產批號:201106099)。ELISPOT試劑盒、小鼠淋巴細胞分離液購自深圳達科為生物技術有限公司。CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術研究所。小鼠FITC-CD3、PE-CD4和PE/Cy5-CD8a熒光抗體購自美國Bio-Legend公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1．3 方法

1．3．1 狂犬病毒G蛋白與N蛋白的表位預測 狂犬病毒的 G蛋白(gi_32440976)與 N蛋白(gi_294999043)氨基酸序列檢索自NCBI數據庫。其中CTL表位采用BIMAS及SYFPEITHI軟件進行預測，Th表位采用RANKPEP進行預測，輸入G蛋白或N蛋白全長序列，選擇相應MHC表型及參數，按結果得分的高低各選擇4條候選多肽用于鑒定實驗。

1．3．2 多肽合成、溶解與分裝 多肽合成由上海強耀生物科技有限公司完成，純度≥90%，共計8條。合成的多肽分別溶解于DMSO中，濃度為5 mg/ml，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3 小鼠分組與免疫 將BALB/c小鼠隨機分為兩組，即實驗組和對照組，每組12只。其中實驗組腹腔注射0．5 ml人用狂犬病疫苗(Vero細胞)，對照組注射相同劑量的生理鹽水。各組小鼠均在第0天和第7天各免疫一次，注射部位與劑量均相同。

1．3．4 多肽刺激的淋巴細胞增殖試驗 小鼠末次免疫后10天斷頭處死，無菌取脾后研磨過濾，用淋巴細胞分離液制成單細胞懸液，調整細胞濃度為106個/ml，加入96 孔細胞培養(yǎng)板，100 μl/孔，同時加入稀釋好的多肽，終濃度為20 μg/ml，陽性對照孔加入終稀釋度為1∶10的狂犬病疫苗原液，空白對照孔為普通1640培養(yǎng)基。將淋巴細胞置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。5天后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，于450 nm處測定吸光度A值，結果以3復孔的平均A450值表示。

1．3．5 ELISPOT法篩選可刺激分泌 IL-4和 IFN-γ的多肽 脾細胞分離后，調整細胞濃度為106個/ml，每只小鼠脾細胞樣品設4個復孔。其余步驟按照試劑盒說明操作:每孔加入100 μl細胞，陽性對照加入10 μl PHA，實驗孔加入 10 μl終濃度為 20 μg/ml的合成多肽，空白對照孔為普通1640培養(yǎng)基。將細胞置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)20小時，棄去細胞樣品，洗滌后加入100 μl生物素標記的抗體，孵育1小時后再次洗滌，加入100 μl酶標親和素，孵育1小時。最后一次洗滌后加入100 μl顯色液于室溫下(25℃)顯色25分鐘，觀察斑點形成。顯色完畢后，用去離子水洗板3次終止反應，將板放置于室溫避光陰涼處，干燥后用ELISPOT讀板機進行讀板計數。

1．3．6 流式細胞法篩選可刺激T細胞反應的多肽脾細胞分離后，調整細胞濃度為107個/ml，加入96孔細胞培養(yǎng)板，100 μl/孔，同時加入稀釋好的多肽，終濃度為20 μg/ml。淋巴細胞培養(yǎng)5天后，收集細胞，每管加入100 μl細胞懸液，并加入FITC antimouse CD3、PE anti-mouse CD4以及 PE/Cy5 antimouse CD8a熒光抗體各2 μl，冰上避光孵育20分鐘。然后離心洗滌細胞2次，去除殘留的熒光抗體。最后以0．5 ml細胞染色緩沖液重懸細胞，轉移至流式管中，上機檢測。

1．4 統計學分析 用統計學軟件SPSS19．0進行統計學處理，結果以±s表示，組間均數差異以t檢驗分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 狂犬病毒G蛋白與N蛋白的表位預測及合成 對NCBI數據庫中獲得的狂犬病毒G蛋白與N蛋白的序列進行CTL表位以及Th表位預測。小鼠的MHCⅠ類分子包括 H-2kd、H-2Dd和 H-2Ld三個亞類，MHCⅡ類分子包括I-Ad和I-Ed兩個亞類。因此為了獲得CTL和Th表位，需要分別對這幾個亞類進行分析與預測。對于MHCⅠ類分子，使用SYFPEITHI和BIMAS軟件進行預測，選擇共同得分較高的4條序列。對于MHCⅡ類分子，使用RANKPEP軟件進行預測，選擇得分較高的4條序列。以上多肽合成后經 HPLC純化，純度在91.34% ～96.65%之間。經質譜分析，合成的多肽實際相對分子質量與理論相符，說明合成的多肽正確，可用于后續(xù)鑒定實驗。所合成的多肽基本信息見表1和表2。

2．2 經多肽刺激后淋巴細胞增殖情況 所合成的8條多肽體外刺激經狂犬疫苗免疫后的BALB/c小鼠脾淋巴細胞，檢測淋巴細胞增殖后的OD值變化，并以刺激指數SI(Stimulation index)值表示結果，SI=實驗孔OD值/陰性孔OD值，如圖1所示。以 SI＞2作為判斷淋巴細胞增殖陽性結果的標準，從結果中可以看出，多肽 G367-381、G137-151、G297-311和 G333-341能夠有效刺激經狂犬疫苗免疫后的小鼠脾淋巴細胞增殖(SI＞2)，同時不能引起生理鹽水對照組小鼠脾細胞的增殖(SI＜2)，因此這4條多肽具有成為表位的可能。

2．3 ELISPOT法篩選可刺激分泌IFN-γ和IL-4的多肽 為了進一步驗證淋巴細胞增殖實驗的結果以及判斷多肽誘導細胞免疫反應的種類，使用ELISPOT法檢測經多肽刺激的淋巴細胞分泌IL-4和IFN-γ的情況。ELISPOT結果中的每一個斑點代表一個分泌IFN-γ或IL-4的T淋巴細胞，稱為斑點形成細胞(Spot forming cell，SFC)，如圖2所示。最后結果以SFC/106個脾細胞表示，反映機體細胞免疫的水平。由圖3的結果可知，經淋巴細胞增殖法初步篩選到的4條多肽中，G367-381及G333-341誘導產生的分泌IFN-γ和IL-4的細胞數量均顯著高于陰性對照組(P ＜0．05)，而G137-151和G297-311誘導產生的分泌IFN-γ和IL-4的細胞數量與陰性對照組并無顯著性差異(P ＞0．05)，說明G367-381及G333-341可確認為狂犬病毒的潛在表位。而從分泌細胞因子的種類來看，這2條多肽均能誘導淋巴細胞分泌Th1型的細胞因子 IFN-γ以及 Th2型的細胞因子 IL-4，其中G367-381主要誘導分泌IL-4，G333-341主要誘導分泌IFN-γ。在先前的表位預測中，G367-381被預測為Th表位，G333-341被預測為CTL表位，因此這一結果提示不同的細胞表位可引起的細胞免疫反應種類有所不同。

表1 狂犬病毒G蛋白與N蛋白CTL表位預測結果Tab．1 The information of the predicted CTL epitopes of glycoprotein and nucleoprotein of rabies virus

表2 狂犬病毒G蛋白與N蛋白Th表位預測結果Tab．2 The information of the predicted Th epitopes of glycoprotein and nucleoprotein of rabies virus

圖1 合成的多肽刺激小鼠脾淋巴細胞增殖Fig．1 Proliferation of spleen cells of immunized mice after stimulation of synthetic peptides

圖2 合成多肽刺激小鼠脾細胞分泌IFN-γ和IL-4 ELISPOT斑點圖Fig．2 Spot forming pictures of IFN-γ-and IL-4-secreting splenocytes of immunized mice induced by synthetic peptides

2．4 流式細胞法篩選可刺激T細胞反應的多肽為了進一步驗證ELISPOT篩選法的結果以及分析候選表位的種類，使用流式細胞法檢測多肽對CD4+與CD8+T細胞刺激增殖的情況。由于CD3是T細胞的特有標記，因此以CD3設門，檢測增殖的CD3+CD4+T細胞以及CD3+CD8+T細胞占脾淋巴細胞的百分比。結果如表3顯示，G367-381及G333-341刺激增殖的CD3+CD4+T細胞以及CD3+CD8+T細胞百分比均顯著高于陰性對照組(P＜0．05)，而G137-151和G297-311刺激增殖的CD3+CD4+T細胞以及CD3+CD8+T細胞百分比與陰性對照組相比無顯著差異(P＞0．05)，這一結果與先前ELISPOT的結果相符，進一步表明多肽G367-381及G333-341可能成為狂犬病毒的潛在表位。從誘導產生的細胞免疫反應種類來分析，2條多肽中，G367-381主要誘導產生以CD3+CD4+T細胞增殖為主的Th型免疫應答，而G333-341則主要誘導產生以CD3+CD8+T細胞增殖為主的CTL型免疫應答，綜合ELISPOT結果中IL-4與IFN-γ細胞因子的分泌情況，可初步確定G367-381是潛在的Th表位，而G333-341則可能成為CTL表位。

圖3 合成的多肽刺激小鼠脾細胞分泌IFN-γ和IL-4Fig．3 IFN-γ and IL-4 secreting in splenocytes of immunized mice induced by synthetic peptides

表3 合成多肽刺激小鼠CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞增殖情況Tab．3 Proliferation of CD3+CD4+T and CD3+CD8+T cells in mice induced by synthetic peptides

3 討論

現有的狂犬疫苗盡管能夠提供一定的保護作用，但往往存在免疫原性較差、抗體產生緩慢、免疫程序繁瑣等不足，在嚴重的情況下，患者還需要同時注射昂貴的免疫球蛋白進行輔助治療［11］。機體在狂犬病毒侵入后，一般通過產生中和抗體以及細胞免疫反應兩種途徑清除感染，中和抗體只能清除游離于細胞外的病毒，而對于進入細胞內的病毒，只能依靠細胞免疫的殺傷作用進行清除，因此細胞免疫對于預防和清除狂犬病毒的感染非常重要［17］。一些研究也表明，CD4+和CD8+T細胞誘導的Th以及CTL免疫應答能夠通過分泌一系列細胞因子如IL-4、TNF-α、IFN-γ等在抵御狂犬病毒感染的過程中發(fā)揮關鍵的作用［18］。

表位疫苗作為近年來新發(fā)展起來的一種新型疫苗技術，其含有能夠被機體免疫細胞直接識別的MHC限制性多肽，能夠產生具有細胞殺傷作用的CTL和促進中和抗體產生的Th免疫應答反應，對于清除病毒感染和提供免疫保護具有重要的作用［19，20］。目前，表位疫苗已經在部分病毒疫苗的研究中取得了顯著的成效，如針對A型流感病毒M2蛋白的表位疫苗已經在小鼠和恒河猴上進行了臨床前研究，并取得了一定的效果［21］;丙型肝炎(HCV)的治療性表位疫苗經過人體實驗也證明了其較好的免疫原性和安全性［22］。這些結果都表明表位疫苗能夠克服傳統疫苗的種種不足，是一種具有廣闊前景的新型疫苗，但同時表位疫苗還存在免疫原性較弱、在體內容易被降解等不足，需要進一步的改進。

研究表位疫苗首先必須篩選到合適的多肽表位，在以往篩選表位的過程中，重疊肽法是一種經典的實驗方法，此方法不易發(fā)生漏選的情況，但是需要合成大量的肽段，所需時間較長，費用較高，對于較長的蛋白序列并不適用［23］。近年來，隨著人們對MHCⅠ類及Ⅱ類分子與抗原肽結合規(guī)律的逐步認識，用生物信息學研究細胞表位的方法已經得到了廣泛的應用，與重疊肽法相比，計算機軟件預測能夠節(jié)省大量時間與成本，并且提高篩選的準確率［24］。

本研究利用生物信息學軟件 BIMAS、SYFPEITHI以及RANKPEP對狂犬病毒的糖蛋白以及核蛋白的CTL和Th表位進行預測，其中BIMAS和SYFPEITHI通過矩陣法分析抗原每一種氨基酸在MHCⅠ類配體特定位點上出現的頻率來預測CTL表位［12］。RANKPEP通過位置特異性打分矩陣的算法對較長片段的Th表位進行預測，克服了之前預測軟件只對簡單序列模式進行預測的不足，故準確率較高［14］。本研究通過運用三種生物信息學軟件，從狂犬病毒的糖蛋白與核蛋白序列中預測出8條可能成為細胞表位的多肽，并利用體外淋巴細胞增殖實驗進行初步篩選，以及ELISPOT和流式細胞法進行進一步的篩選，最終獲得2條可能成為細胞表位的多肽G367-381及G333-341，并通過實驗結果證明了G367-381能誘導Th型免疫應答，是潛在的Th表位，而G333-341則可誘導CTL型的免疫應答，可能成為CTL表位。

綜上所述，本研究以BALB/c小鼠為哺乳動物模型，結合生物信息學與免疫學實驗方法，預測并篩選出2條狂犬病毒蛋白的Th及CTL表位，這將為進一步開發(fā)狂犬病毒的表位疫苗及其應用提供實驗依據。

1 Faber M，Li J，Kean R B et al．Effective preexposure and postexposure prophylaxis of rabies with a highly attenuated recombinant rabies virus［J］ ． ProcNatlAcadSciUSA，2009;106(27):11300-11305．

2 Yu J，Li H，Tang Q et al．The spatial and temporal dynamics of rabies in China［J］．PLoS Negl Trop Dis，2012;6(5):e1640．

3 Zhang L，Wilson D P．Trends in notifiable infectious diseases in China:implications for surveillance and population health policy［J］．PLoS One，2012;7(2):e31076．

4 Dietzschold B，Wang H H，Rupprecht C E et al．Induction of protective immunity against rabies by immunization with rabies virus ribonucleoprotein［J］ ．Proc Natl Acad Sci USA，1987;84(24):9165-9169．

5 Dietzschold B，Ertl H C．New developments in the pre-and post-exposure treatment of rabies［J］．Crit Rev Immunol，1991;10(5):427-439．

6 Fu Z F，Dietzschold B，Schumacher C L et al．Rabies virus nucleoprotein expressed in and purified from insect cells is efficacious as a vaccine［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1991;88(5):2001-2005．

7 Ertl H C，Dietzschold B，Gore M et al．Induction of rabies virus-specific T-helper cells by synthetic peptides that carry dominant T-helper cell epitopes of the viral ribonucleoprotein［J］．J Virol，1989;63(7):2885-2892．

8 Larson J K，Wunner W H，Otvos L J et al．Identification of an immunodominant epitope within the phosphoprotein of rabies virus that is recognized by both class I-and class II-restricted T cells［J］．J Virol，1991;65(11):5673-5679．

9 Otvos L J，Urge L，Xiang Z Q et al．Glycosylation of synthetic T helper cell epitopic peptides influences their antigenic potency and conformation in a sugar location-specific manner［J］．Biochim Biophys Acta，1994;1224(1):68-76．

10 Hagmann M．Computers aid vaccine design［J］．Science，2000;290(5489):80-82．

11 Rammensee H，Bachmann J，Emmerich N P et al．SYFPEITHI:database for MHC ligands and peptide motifs［J］．Immunogenetics，1999;50(3-4):213-219．

12 Schuler M M，Nastke M D，Stevanovikc S．SYFPEITHI:database for searching and T-cell epitope prediction［J］．Methods Mol Biol，2007;409:75-93．

13 Parker K C，Bednarek M A，Coligan J E．Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains［J］ ．J Immunol，1994;152(1):163-175．

14 Reche P A，Glutting J P，Zhang H et al．Enhancement to the RANKPEP resource for the prediction of peptide binding to MHC molecules using profiles［J］ ．Immunogenetics，2004;56(6):405-419．

15 Ertl H C．Novel vaccines to human rabies［J］．PLoS Negl Trop Dis，2009;3(9):e515．

16 Shen E，Li L，Li L et al．PIKA as an adjuvant enhances specific humoral and cellular immune responses following the vaccination of mice with HBsAg plus PIKA ［J］ ．Cell Mol Immunol，2007;4(2):113-120．

17 Moore S M，Wilkerson M J，Davis R D et al．Detection of cellular immunity to rabies antigens in human vaccinees［J］．J Clin Immunol，2006;26(6):533-545．

18 Hooper D C．The role of immune responses in the pathogenesis of rabies［J］．J Neurovirol，2005;11(1):88-92．

19 Kirnbauer R，Booy F，Cheng N et al．Papillomavirus L1 major capsid protein self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1992;89(24):12180-12184．

20 Martinez C，Dalsgaard K，Lopez D T J et al．Production of porcine parvovirus empty capsids with high immunogenic activity［J］．Vaccine，1992;10(10):684-690．

21 Fan J，Liang X，Horton M S et al．Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice，ferrets，and rhesus monkeys［J］．Vaccine，2004;22(23-24):2993-3003．

22 Firbas C，Jilma B，Tauber E et al．Immunogenicity and safety of a novel therapeutic hepatitis C virus(HCV)peptide vaccine:a randomized，placebo controlled trial for dose optimization in 128 healthy subjects［J］．Vaccine，2006;24(20):4343-4353．

23 Aoshi T，Suzuki M，Uchijima M et al．Expression mapping using a retroviral vector for CD8+T cell epitopes:definition of a Mycobacterium tuberculosis peptide presented by H2-Dd［J］ ．J Immunol Methods，2005;298(1-2):21-34．

24 Reche P A，Glutting J P，Reinherz E L．Prediction of MHC class I binding peptides using profile motifs［J］ ．Hum Immunol，2002;63(9):701-709．