黃 湘 譚家余 袁春雷 周 濤 羅雅玲

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山市博愛(ài)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，中山528402)

CHIA和 CHI3L1基因編碼產(chǎn)物 AMCase和YKL-40蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶之一。幾丁質(zhì)(Chitin)又名殼多糖，是存在于真菌細(xì)胞壁、蠕蟲(chóng)微絲蚴鞘以及昆蟲(chóng)和介蟲(chóng)的外骨骼中，是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β1-4糖苷鍵連接而成的線性多糖。幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)中β1-4糖苷鍵的水解，有助于上述有機(jī)體的結(jié)構(gòu)重塑，并能提供重要的能量來(lái)源。研究顯示AMCase和YKL-40 蛋白在哮喘中表達(dá)增加［1，2］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)應(yīng)編碼基因CHIA和CHI3L1的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)可能與哮喘的易感性有關(guān)，但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道甚少。本研究采用全新技術(shù)MassARRAY-IPLEX技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)來(lái)探討CHIA和CHI3L1基因的SNPs是否與哮喘的易感性有關(guān)，為它們?cè)谙械淖饔脵C(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 臨床資料 按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)哮喘學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，選取2010年8月～2012年2月年確診的中山市漢族兒童支氣管哮喘患者為研究對(duì)象，無(wú)其它慢性疾病史。對(duì)照組選自同期健康查體者，均無(wú)哮喘和過(guò)敏性鼻炎史、個(gè)人及家族過(guò)敏史。所有受檢者相互間無(wú)血緣關(guān)系，抽血前簽署知情同意書(shū)，填寫(xiě)一般資料調(diào)查表，并采集空腹外周血2 ml。

1．1．2 試劑和儀器 DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit);低溫超速離心機(jī)(Harris);SpectroCHIP芯片(Sequenom);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Spectro-READER，Sequenom)。

1．2 方法

1．2．1 基因組 DNA提取 用 TIANamp Genomic DNA Kit提取外周血DNA，按說(shuō)明書(shū)操作，DNA保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 位點(diǎn)選擇和引物設(shè)計(jì) 選取CHIA基因的rs10494132和CHI3L1的rs946263位點(diǎn)為研究靶點(diǎn)。采用Sequenom公司的軟件Assay Design 3．1進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并由上海英駿生物公司(Invitrogen)合成，其中針對(duì)rs10494132特異性擴(kuò)增的引物為5'-ACGTTGGATGTTAAGATCATCGAGCCTAGC-3'和5'-ACGTTGGATGAGATGCTGAGTCAAGTTCCC-3'，單堿基延伸的引物為5'-AGCCTAGCATTCCATGA-3'。針對(duì)rs946263特異性擴(kuò)增的引物為5'-ACGTTGGATGGATCCCTGACTTTTGCTCTG-3'和5'-ACGTTGGATGTCATGGTGGAAAACAGCAAC-3'，單堿基延伸的引物為5'-GCTGAAGTCTGAGGATACG-3'。

1．2．3 SNPs檢測(cè)［4］提取純化后的基因組 DNA樣品定量稀釋，按設(shè)計(jì)順序加樣于384孔板上，然后添加PCR擴(kuò)增體系使反應(yīng)物的終濃度如下:0．1 U的Taq聚合酶，5 ng基因組 DNA，各 2．5 pmol的PCR引物，2．5 mmol的 dNTP。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 15分鐘，然后45個(gè)循環(huán)的95℃ 20秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒。剩余的dNTP經(jīng)添加0．3 U的堿性磷酸酶去除。單堿基延伸過(guò)程通過(guò)添加5．4 pmol的各延伸引物，50 μmol的 dNTP/ddNTP 混合物，0．5 U的 Thermosequenase DNA聚合酶，反應(yīng)條件為94℃ 2分鐘，然后40個(gè)循環(huán)的 94℃ 5秒，50℃ 5秒，72℃ 5秒。反應(yīng)產(chǎn)物用樹(shù)脂脫鹽后經(jīng)自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于SpectroCHIP(Sequenom)芯片。點(diǎn)制后的芯片用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SpectroREADER，Sequenom)檢測(cè)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分別統(tǒng)計(jì)病例組和對(duì)照組基因型分布頻率，經(jīng) Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)后，用SPSS13．0軟件包進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料間的比較采用χ2檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 一般資料 哮喘患者和同期健康查體者均來(lái)自廣東省中山市漢族兒童。入選哮喘組患者共158例，其中男104例，女54例，年齡(46．23±39．62)月。對(duì)照組共198例，其中男128例，女70例，年齡(46．23 ±39．62)月。兩組間性別(χ2=0．054，P=0．817)和年齡(t= － 0．313，P=0．754)無(wú)明顯差異。

2．2 rs10494132和rs946263位點(diǎn)的基因型特征質(zhì)譜圖 rs10494132位點(diǎn)的CT基因型在C和T等位基因處均有峰，CC、TT基因型分別在C、T等位基因處都有峰(如圖1)。rs946263位點(diǎn)AG基因型在A和G等位基因處均有峰，AA基因型在A等位基因處有峰，圖中未顯示GG基因型。Haploview4．1軟件分析結(jié)果顯示rs10494132和rs946263的SNPs在病例組和對(duì)照組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＞0．05)?；蚍中统晒β?00%。

2．3 rs10494132和rs946263基因多態(tài)性與哮喘易感性的關(guān)系 與正常對(duì)照相比，哮喘組rs10494132的基因型分布(χ2=8．767，P=0．012)和等位基因分布(χ2=9.749，P=0．002)均具有明顯差異(表1)，而 rs946263 基因型分布(χ2=0．472，P=0．790)和等位基因分布(χ2=0．013，P=0．910)均無(wú)顯著性差異(表2)。如表3，與 CC+CT基因型相比，rs10494132的TT基因型能顯著增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，OR值(95%可信區(qū)間)分別為2．093(1．252～3．498)。

2．4 rs10494132位點(diǎn)對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和IgE的影響 如表4，在哮喘組中，與CC+CT基因型亞組相比，rs10494132的TT基因型亞組IgE濃度(Z=－2．013，P=0．044)明顯增高，而嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(Z= －0．704，P=0．482)和 CRP(Z= －0．488，P=0．626)無(wú)明顯變化。

圖1 rs10494132和rs946263位點(diǎn)的基因型特征質(zhì)譜圖Fig．1 The genotype characteristic mass spectrum of rs10494132 and rs946263

表1 rs10494132多態(tài)性和與哮喘易感性的關(guān)系［n(%)］Tab．1 The relationship between rs10494132 polymorphism and asthma susceptibility［n(%)］

表2 rs946263多態(tài)性和與哮喘易感性的關(guān)系［n(%)］Tab．2 The relationship between rs946263 polymorphism and asthma susceptibility［n(%)］

表3 rs10494132與發(fā)生哮喘風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析Tab．3 Association analysis between rs10494132 and asthma risk

表4 rs10494132與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和IgE的關(guān)系Tab．4 The relationship between rs10494132 and eosinophil cell count and IgE

表5 rs10494132位點(diǎn)與哮喘規(guī)則治療前病情嚴(yán)重程度分級(jí)的關(guān)系Tab．5 The relationship between rs10494132 and the grade of the severity of initially diagnosed asthma before regular treatment

2．5 rs10494132位點(diǎn)與哮喘初次確診規(guī)則治療前病情嚴(yán)重程度分級(jí)的關(guān)系 如表5，rs10494132位點(diǎn)的基因型分布在哮喘初次確診規(guī)則治療前不同病情嚴(yán)重程度分級(jí)之間未見(jiàn)明顯差異(χ2=0．719，P=0．397)。

3 討論

CHIA 基因位于染色體 1p13．1-p21．3，又名:AMCASE等。其編碼蛋白AMCase可促進(jìn)Th2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［5］，還可以促進(jìn)IL-13的表達(dá)。在哮喘患者中AMCase表達(dá)量明顯增高，運(yùn)用特異性抑制劑可以減輕患者的炎癥反應(yīng)［1］。Heinzmann 等［6］研究顯示CHIA的基因變異與疾病有關(guān)，單倍型為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析顯示AMCase與IL-4或IL-13具有協(xié)同作用。Birben等［7］通過(guò)對(duì)CHIA基因啟動(dòng)子和外顯子1和2區(qū)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)5'UTR區(qū)域的一個(gè)10個(gè)堿基對(duì)插入可能改變基因的表達(dá)和肺功能。在高加索人群中［8］，COPD患者的FEV1在rs3818822位點(diǎn)的AA和GG基因型兩組中具有顯著性差異。與AA純合子相比，GG基因型患者AMCase蛋白和幾丁質(zhì)酶的活性較高。Leung等［9］認(rèn)為CHIA與兒童濕疹有關(guān)。有報(bào)道CHIA基因的一個(gè)外顯子變異(rs3818822)與德國(guó)兒童哮喘有關(guān)［10］。Chatterjee等［11］在印度人群中發(fā)現(xiàn)rs3806448基因多態(tài)性與過(guò)敏性哮喘以及血清總IgE水平具有顯著相關(guān)性。此外rs2282290也與過(guò)敏性哮喘相關(guān)，而rs10494132多態(tài)性與血清總 IgE相關(guān)。Chatterjee等［11］認(rèn)為rs10494132的SNPs改變了CHIA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，C變成T八聚體轉(zhuǎn)錄因子-1結(jié)合位點(diǎn)失去作用。而Wu等［12］的研究則認(rèn)為CHIA多態(tài)性與哮喘無(wú)關(guān)(含RS10494132)。從上述系列研究可以看出CHIA基因的SNPs可能參與基因表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)，可作為哮喘的一個(gè)易感因素，但結(jié)論不完全相同，國(guó)內(nèi)在兒童哮喘中尚缺乏這方面大樣本的研究。本研究初步顯示，與正常對(duì)照相比，哮喘組rs10494132的基因型分布和等位基因分布均具有明顯差異。與CC+CT基因型相比，rs10494132的TT基因型能顯著增加哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)性，OR值(95%可信區(qū)間)分別為 2．093(1．252 ～3．498)。在哮喘組中，與 CC+CT基因型亞組相比，rs10494132的TT基因型亞組IgE濃度明顯增高。提示rs10494132與哮喘的發(fā)病有關(guān)并影響血清IgE濃度。

CHI3L1基因位于染色體1q31-q32，其基因編碼產(chǎn)物是YKL-40。YKL-40由激活的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，具有多種生理功能。而CHI3L1的基因變異也與疾病有關(guān)，Lee等［13］使用YKL-40的轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)缺少YKL-40基因的小鼠Th2炎癥反應(yīng)及IL-13介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)都明顯受到抑制。在基因多態(tài)性研究中，與哮喘發(fā)病關(guān)系比較明確而且報(bào)道比較多的位點(diǎn)是rs4950928，Cunningham［14］發(fā)現(xiàn) CHI3L1 的 rs4950928的多態(tài)性與兒童和年輕人哮喘有關(guān)。Ober等［2］報(bào)道rs4950928不僅與血清YKL-40的水平有關(guān)，而且與哮喘及肺功能具有相關(guān)性。同時(shí)Sohn等［15］發(fā)現(xiàn)CHI3L1的rs10399805和rs2275353均與變態(tài)反應(yīng)性密切相關(guān)。但也有相反的結(jié)論，Wu等［12］卻發(fā)現(xiàn)，在輕到中度哮喘的患者中，CHI3L1的單核苷酸多態(tài)性與哮喘患病率、肺功能的改變以及哮喘表型無(wú)關(guān)。有研究顯示rs946263與CHI3L1的表達(dá)水平有關(guān)，在兒童哮喘的研究中，發(fā)現(xiàn)rs946263與rs4950928位點(diǎn)呈強(qiáng)連鎖不平衡，影響CHI3L1的轉(zhuǎn)錄水平［14］。Lin等［16］也證實(shí) CHI3L1的 rs946263和 NPPA 的rs5065位點(diǎn)存在著一種所謂的觸發(fā)器關(guān)系，但無(wú)論是生理上和臨床上，目前這種關(guān)系的意義還不清楚。而含有rs5065位點(diǎn)C等位基因的人群的哮喘危險(xiǎn)性下降，提示NPPA的基因多態(tài)性與哮喘有關(guān)［17］。那么rs946263是否直接與哮喘有關(guān)呢?國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，我們的初步研究發(fā)現(xiàn)，rs946263與中山市兒童哮喘的易感性無(wú)關(guān)。

本研究利用MassARRAY-IPLEX技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)對(duì)SNPs進(jìn)行了檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，且分型成功率達(dá)到100%。但樣本量相對(duì)較小，相關(guān)結(jié)論有待于大樣本和多人群的進(jìn)一步驗(yàn)證。

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