肖煒明 吳克艷 龔衛(wèi)娟 丁巖冰 王 艷 卜 平

(揚州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科，揚州225001)

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)被認為是一種重要的促腫瘤生長因子。其不僅通過旁分泌途徑刺激腫瘤血管內(nèi)皮細胞增生、遷移，誘導(dǎo)血管形成而促進腫瘤生長;還具有增強血管通透性，促進單核細胞、成纖維細胞及內(nèi)皮細胞浸潤，有利于腫瘤基質(zhì)形成，促進腫瘤轉(zhuǎn)移的活性［1，2］。另外，VEGF 還具有免疫調(diào)節(jié)功能，可通過降低體內(nèi)免疫監(jiān)視功能而促進免疫逃逸［3，4］。樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)作為體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞，具有很強的攝取、加工、遞呈抗原的能力，從而激發(fā)抗原特異性的T細胞免疫反應(yīng)，既往研究也已經(jīng)證實DCs的浸潤及其功能與胃癌的預(yù)后、TNM 分期等密切相關(guān)［5，6］。因此，本文試圖觀察胃癌組織VEGF表達強度、血清VEGF濃度分別與胃癌組織內(nèi)DCs浸潤密度的關(guān)系，胃癌組織內(nèi)VEGF陽性DCs浸潤頻率與胃癌發(fā)生與發(fā)展的關(guān)聯(lián);胃癌患者與健康個體外周血單核來源DCs表面HLA-DR和CD86的表達，從而深入揭示VEGF調(diào)節(jié)DCs活性參與胃癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移的分子機制。

1 材料與方法

1．1 臨床資料 收集2009年4月至2012年7月經(jīng)我院外科手術(shù)，病理證實為胃癌的組織標(biāo)本142例，其中男性101例，女性41例，平均年齡(61．94±10．23)歲。所有入選病例均無長期使用非甾體消炎藥和糖皮質(zhì)激素類藥，術(shù)前均未接受過放療或化療。腫瘤組織學(xué)類型按WHO分級，高中分化腺癌76例，低/未分化腺癌66例;腫瘤大小:＜5 cm者81例，≥5 cm者61例;發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者97例，無局部淋巴轉(zhuǎn)移者45例;未侵及漿膜層者60例，侵及漿膜層者82例;根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)頒布的第7版胃癌TNM分期系統(tǒng)進行臨床分期:Ⅰ期/Ⅱ期74例，Ⅲ期/Ⅳ 期68例。隨機選取37例癌旁組織作為對照組，并經(jīng)過病理檢查排除累及腫瘤。隨機取20例患者血清，其中男性13例，女性7例，平均年齡(57．90±12．43)歲;健康個體20例，其中男性 12例，女性 8例，平均年齡(56．91±9．68)歲。隨機取5例胃癌患者和5例健康個體外周血單個核細胞(PBMC)，經(jīng)體外誘導(dǎo)為DCs。

1．2 實驗材料 鼠抗人VEGF單克隆抗體(mAb)購自Santa Cruz公司;Alex488標(biāo)記的驢抗鼠、羊抗兔抗體購自Invitrogen公司;兔抗人CD11c抗體購自武漢博士德公司;APC-CD11c mAb、FITC-HLA-DR mAb、PE-CD86 mAb來自 Biolegend公司;人 VEGF ELISA檢測試劑盒購自深圳達科為公司;DAPI封片劑購自 VECTASHIELD公司;重組人 GM-CSF、IL-4購自PeproTech公司;重組人VEGF蛋白(rhVEGF)購自R＆D公司;外周血淋巴細胞分離液(Ficoll)購自挪威Axis-shield公司。

1．3 方法

1．3．1 免疫熒光法檢測腫瘤組織 VEGF表達及DCs密度 腫瘤組織經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚4 μm。石蠟切片脫蠟后，梯度酒精水化，95～99℃水浴抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，2%驢或山羊血清室溫封閉30分鐘。然后孵育鼠抗人VEGF(1∶50 稀釋)及兔抗人 CD11c(1∶50 稀釋)抗體4℃過夜。PBS洗滌后，同時孵育驢抗鼠、羊抗兔熒光二抗(1∶1 000稀釋)37℃避光孵育30分鐘，PBS洗滌，自然晾干后，滴加DAPI封片，熒光顯微鏡觀察。

1．3．2 CD11c陽性細胞判斷標(biāo)準 細胞形態(tài)完整且不規(guī)則，胞漿有明顯突起，分布在腫瘤細胞間和(或)腫瘤間質(zhì)內(nèi)。紅色熒光特異地定位于胞膜內(nèi)的細胞為陽性細胞。染色結(jié)果按參考文獻［7］判斷:陰性(－)沒有或僅有少許染色細胞;陽性(+)散在的染色細胞;陽性(++)癌巢多個染色細胞;陽性(+++)彌散的染色細胞。

1．3．3 VEGF陽性細胞判斷標(biāo)準 細胞形態(tài)完整，胞漿著綠色熒光，染色結(jié)果判斷分別按陽性染色細胞百分數(shù)及染色強度計分［8］。陽性細胞數(shù)為0，計0分;1%～10%計1分;11% ～50%計2分;51%～75%計3分;＞75%計4分。染色陰性計0分;淡綠色計1分;綠色計2分;深綠色計3分。兩種積分相加，積分為0～2分，表示陰性(－);積分≥3分為陽性。其中積分為3分，表示陽性(+);積分為4～5分，表示陽性(++);積分為6～7分，表示陽性(+++)。

1．3．4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清VEGF濃度 按試劑盒提供的操作說明進行，主要步驟:加血清至各檢測孔，室溫孵育2小時;洗板3次，加檢測抗體;混勻后蓋上封板膜，室溫孵育2小時;洗板3次，加酶標(biāo)記底物。蓋上封板膜，室溫孵育20分鐘;洗板3次;加入TMB顯色，室溫避光溫育20分鐘終止反應(yīng);10分鐘內(nèi)在波長450 nm讀值。根據(jù)標(biāo)準品繪制標(biāo)準曲線，計算各檢測孔內(nèi)VEGF濃度。

1．3．5 外周血單核細胞誘導(dǎo)為DCs 利用Ficoll分離外周血單個核細胞，調(diào)整細胞密度為2×106ml－1。將細胞鋪于 24 孔板中培養(yǎng)，每孔 500 μl，約1×106個細胞/孔，并加細胞因子 GM-CSF(100 ng/ml)、IL-4(40 ng/ml)，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)。隔日半量換液，培養(yǎng)5天誘導(dǎo)成DCs。

1．3．6 DCs表面 HLA-DR和 CD86表達的檢測

取外周血單核細胞誘導(dǎo)而來的細胞懸液，經(jīng)PBS洗滌后加入 APC-CD11c mAb、FITC-HLA-DR mAb、PECD86 mAb 4℃避光孵育30分鐘后，PBS洗滌后400 μl重懸。利用FACS Calibur流式細胞儀，Cellquest軟件計數(shù)104個細胞，選取CD11c陽性細胞，進而分析HLA-DR及CD86的表達。

1．3．7 重組VEGF(rhVEGF)對DCs表達HLA-DR、CD86的影響 將正常個體和胃癌患者PBMC誘導(dǎo)為未成熟DC后，實驗分組加rhVEGF 100 ng/ml，對照組不加藥物，兩組分別刺激未成熟DC 24小時后，F(xiàn)CM檢測DC表達CD86的情況。

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析 胃癌與癌旁組織VEGF表達、DCs浸潤密度的比較采取χ2檢驗分析;VEGF表達強度與DCs浸潤密度的關(guān)聯(lián)采取Spearman等級相關(guān)分析;VEGF、DCs雙陽性細胞與TNM及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性分析采用秩和檢驗;胃癌患者血清VEGF濃度與健康個體的比較、HLA-DR及CD86陽性DCs頻率的比較均采取t檢驗。P＜0．05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 胃癌組織VEGF表達與DC浸潤密度的關(guān)聯(lián)分析 首先對胃癌組織和癌旁組織分別用VEGF和CD11c的抗體進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)胃癌組織VEGF陽性表達率 56．33%(圖 1)、而癌旁組織VEGF陽性表達率僅為18．91%。另外，胃癌組織內(nèi)CD11c+細胞的表達陽性率為60．56%(圖1)、而癌旁組織的陽性表達率為62．16%。結(jié)果顯示胃癌組織中VEGF陽性表達率明顯高于癌旁組織(χ2=16.452，P ＜0．001);而 CD11c+細胞表達率略低于癌旁組織(χ2=0．032，P=0．859)，但統(tǒng)計學(xué)無意義。為進一步明確腫瘤組織VEGF表達是否與DCs浸潤密度有相關(guān)性，對胃癌組織VEGF表達情況和DCs浸潤情況分別判定為“－、+、++、+++”4個等級，利用Spearman等級相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)VEGF表達強度與 DCs浸潤程度呈反向關(guān)聯(lián)(表1，rS=－0.426，P ＜0．001)，提示胃癌細胞可通過分泌VEGF抑制腫瘤組織內(nèi)DCs的浸潤。

圖1 免疫熒光法檢測胃癌組織內(nèi)VEGF和CD11c陽性的細胞(×200)Fig．1 VEGF and CD11c staining in gastric cancer tissues detected by immunofluorescence technique(×200)

表1 胃癌細胞VEGF表達水平與DC密度相關(guān)性分析Tab．1 Correlation study of VEGF expression level in cancer cells and density of tumor-infiltrating DCs

2．2 胃癌組織VEGF陽性DCs浸潤的頻率與胃癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)分析 國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)DCs可分泌VEGF、內(nèi)皮素-1等參與腫瘤血管生成，特別是腫瘤局部微環(huán)境PGE2和鈣三醇的刺激可誘導(dǎo)DCs分泌大量的VEGF，進而介導(dǎo)腫瘤血管生成和免疫逃逸［9］。因此本研究分析了胃癌組織和癌旁組織內(nèi)CD11c+VEGF+雙陽性細胞的密度(圖 2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中 CD11c+VEGF+雙陽性細胞頻率為43．66%，癌旁組織雙陽性細胞率為10．81%，胃癌組織中雙陽性細胞表達率明顯高于癌旁組織(表 2，χ2=14.112，P=0.001)。另外，我們分析了CD11c+VEGF+細胞密度與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性(表3:Z=－2.367，P=0．018;表 4:Z= － 2．574，P=0.010)，結(jié)果顯示CD11c+VEGF+細胞密度與疾病的進展、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均正相關(guān)。

圖2 雙色熒光標(biāo)記檢測胃癌組織內(nèi)VEGF和CD11c雙陽性細胞(×200)Fig．2 Immunofluorescent staining of VEGF and CD11c double positive cells in gastric cancer tissues(×200)

2．3 血清VEGF濃度及腫瘤組織內(nèi)DC浸潤密度的關(guān)聯(lián)分析 為分析胃癌患者血清VEGF濃度和腫瘤組織內(nèi)DC浸潤密度是否關(guān)聯(lián)，我們首先比較20例胃癌患者和20例健康個體血清內(nèi)VEGF水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清內(nèi) VEGF濃度均值為(354.98 ±231．11)pg/ml，而健康個體 VEGF 濃度均值為(66．11 ±62．86)pg/ml，胃癌患者血清內(nèi) VEGF濃度顯著增高(圖3，t=5．394，P ＜0．001)。進一步分析胃癌患者血清VEGF濃度與腫瘤組織內(nèi)DCs密度的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)二者沒有明顯的關(guān)聯(lián)性(rS=0.114，P=0．63)。提示血清VEGF濃度對腫瘤組織內(nèi)DCs遷移沒有影響。

2．4 胃癌外周血單核細胞來源DCs表面HLA-DR及CD86表達的檢測 為觀察胃癌患者體內(nèi)DCs細胞的活性狀態(tài)，分離5例胃癌和5例健康個體外周血單核細胞，經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)為DCs，分別檢測CD11c細胞表面MHCⅡ類分子(HLA-DR)和共刺激分子CD86的表達。HLA-DR在健康個體及胃癌患者表達率分別為(99．86 ±0．06)%、(84．44 ±8．73)%(t=4．241，P=0．003);CD86 在健康個體及胃癌患者表達率分別為(62.48±10.46)%、(40.82 ±5．42)%(t=4．111，P=0．003)(圖 4 ～6)。結(jié)果顯示，與健康個體相比，胃癌患者外周血單個核細胞來源DCs表面HLA-DR和CD86的表達均降低。為分析DCs表面CD86表達的降低是否與胃癌血清高水平VEGF有關(guān)，我們將rhVEGF作用胃癌患者來源的DCs細胞，測得rhVEGF組的CD86表達為(37．94±6．36)%，對照組為(56.70±7.80)%，(t=5．104，P=0．001);而 rhVEGF 作用健康個體來源的 DCs細胞，rhVEGF組的 CD86為(54．30 ±3．81)%，對照組為(57．08 ±6．43)%，(t=0.832，P=0．430)(圖 7)。結(jié)果證實重組VEGF可直接下調(diào)胃癌患者 DCs表面 CD86的表達。

表2 胃癌與癌旁組織內(nèi)CD11c+VEGF+細胞密度比較Tab．2 Comparative analysis of density of CD11c+VEGF+cells in gastric cancer tissues and adjacent tissues

表3 腫瘤組織內(nèi)CD11c+VEGF+細胞密度與TNM分期關(guān)聯(lián)性分析Tab．3 Correlation study of density of CD11c+VEGF+cells in tumor tissues with TNM stages

表4 腫瘤組織內(nèi)CD11c+VEGF+細胞密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)性分析Tab．4 Association correlation study of densitiesof CD11c+VEGF+cells in tumor tissues with lymph node metastasis

圖3 胃癌患者血清VEGF濃度較正常個體顯著增高Fig．3 Serum level of VEGF is higher in gastric cancer patients than healthy controls

圖4 外周血單核細胞誘導(dǎo)而來DCs表面HLA-DR和CD86的檢測Fig．4 Detection of HLA-DR and CD86 expression on peripheral blood monocyte-derived DCs by flow cytometry

圖5 胃癌患者外周血單核細胞來源DCs表面HLA-DR的表達降低Fig．5 Decreased expression of HLA-DR on peripheral monocyte-derived DCs in gastric cancer

圖6 胃癌患者外周血單核細胞來源DCs表面CD86的表達降低Fig．6 Decreased expression of CD86 on peripheral monocyte-derived DCs in gastric cancer

圖7 重組VEGF下調(diào)胃癌患者外周血單核細胞來源DCs表面表達HLA-CD86Fig．7 Recombinant VEGF down-regulated CD86 expression on DCs in gastric cancer

3 討論

本研究基于胃癌臨床標(biāo)本，首先利用免疫熒光和ELISA方法分別分析了腫瘤組織內(nèi)胃癌細胞VEGF表達、血清VEGF濃度與腫瘤組織內(nèi)DCs浸潤密度的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)胃癌細胞原位表達VEGF與DCs浸潤存在明顯的負相關(guān)，而血清VEGF濃度對腫瘤DCs浸潤無明顯影響，提示腫瘤微環(huán)境內(nèi)高濃度VEGF表達可通過抑制DCs的遷移或分化，從而介導(dǎo)免疫逃逸。另外，本研究比較了胃癌組織與癌旁組織分泌VEGF的DCs頻率，發(fā)現(xiàn)癌組織內(nèi)DCs分泌VEGF的頻率顯著高于癌旁組織，提示腫瘤組織內(nèi)浸潤的DCs可能通過分泌VEGF來促進腫瘤血管生成而參與疾病進展。最后，本研究證實外周血單核細胞來源DCs表面HLA-DR和CD86的表達均降低，且重組VEGF可直接抑制DCs表達CD86，說明胃癌患者體內(nèi)DCs處于低活性或負向免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)。因此，本研究為VEGF參與胃癌進展及免疫逃逸提供了直接依據(jù)。

腫瘤細胞在低氧狀態(tài)時分泌大量VEGF，促進腫瘤局部新生血管的生成，且同時抑制局部DCs的功能。國外研究證實VEGF在體外和體內(nèi)抑制DCs細胞的分化、以及抑制LPS誘導(dǎo)的DCs成熟，抑制DCs分泌 IL-12［10，11］。給小鼠注射重組 VEGF 蛋白可拮抗FILT3對DCs的刺激作用［12］。在腫瘤細胞和DCs共培養(yǎng)體系中，加入 VEGF抗體，可促進CD34+細胞向DCs的分化［13］。本研究證實胃癌細胞分泌VEGF與DCs浸潤呈負相關(guān)，但胃癌細胞來源的VEGF是直接抑制DCs的浸潤還是抑制DCs源自造血干細胞的分化發(fā)育過程，尚需深入研究。

血清高水平VEGF促進腫瘤患者的進展，與外周血循環(huán)DCs的密度呈負相關(guān)［14］。本研究則顯示血清VEGF水平與腫瘤浸潤DCs無關(guān)，這提示腫瘤組織內(nèi)DCs活性主要受局部腫瘤細胞來源VEGF的影響。另外，胃癌患者外周血單核細胞來源的DCs表面HLA-DR和CD86均降低，而重組VEGF直接抑制DCs表達CD86，但VEGF是否直接影響DCs對CD4+T/CD8+T細胞的活化，或發(fā)揮調(diào)節(jié)性DCs的活性，促進調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的產(chǎn)生、增殖及活性，需要深入分析。

腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞和局部浸潤的DCs之間存在相互作用(Crosstalk)，特別在腫瘤晚期，腫瘤細胞來源的IL-10、TGF-β、PGE2往往誘導(dǎo)局部DCs具有免疫調(diào)節(jié)和耐受活性，而不是免疫激活功能，主要表現(xiàn)為低表達 TLR4、MHC Ⅱ類分子、CD40、CD80、CD86 和 IL-12，而分泌較多 IL-10［15］。我們在胃癌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了較高頻率VEGF陽性的DCs細胞，且其與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)性，提示該群DCs具有免疫調(diào)節(jié)活性，但這群DCs在胃癌組織內(nèi)如何被誘導(dǎo)產(chǎn)生以及其他表型特點需要深入研究，進而對篩選有效抑制該群DCs活性或誘導(dǎo)DCs向免疫激活方向分化的藥物具有重要意義。

綜上所述，胃癌細胞VEGF的表達強度與腫瘤組織DCs浸潤密度負相關(guān)，而胃癌患者血清高濃度VEGF與其外周血單核細胞來源的DCs表面HLADR和CD86表達降低有關(guān)，腫瘤組織內(nèi)分泌VEGF的DCs頻率與胃癌進展呈正相關(guān)，提示采取靶向抑制腫瘤細胞分泌VEGF和增強DCs功能的治療方法，將有望取得較好的抗腫瘤治療效果。

1 Tie J，Desai J．Antiangiogenic therapies targeting the vascular endothelia growth factor signaling system［J］．Crit Rev Oncog，2012;17(1):51-67．

2 Eichmann A，Simons M．VEGF signaling inside vascular endothelial cells and beyond［J］．Curr Opin Cell Biol，2012;24(2):188-193．

3 Kim H，Kataru R P，Koh G Y．Regulation and implications of inflammatory lymphangiogenesis［J］．Trends Immunol，2012;33(7):350-356．

4 Sheng K C，Wright M D，Apostolopoulos V．Inflammatory mediators hold the key to dendritic cell suppression and tumor progression［J］．Curr Med Chem，2011;18(36):5507-5518．

5 黃海力，吳本儼，龍偉締et al．樹突狀細胞浸潤對進展期胃癌生物學(xué)行為和預(yù)后的影響［J］．中華腫瘤學(xué)雜志，2003;25(5):468-471．

6 Nat sugoe S，Tokuda K，Nakajo A et al．Clinical impact of intratumoralnatural killer cell and dendritic cell infiltration in gastric cancer［J］．Cancer Lett，2000;159(1):103-108．

7 Ohashi S，Okamura S，Urano F et al．Clinicopathological variables associated with lymph node metastasis in submucosal invasive gastric cancer［J］．Gastric Cancer，2007;10(4):241-250．

8 Blanchot-Jossic F，Jarry A，Masson D et al．Up-regulated expression of ADAM17 in human colon carcinoma:co-expression with EGFR in neoplastic and endothelial cells［J］．J Pathol，2005;207(2):156-163．

9 Sozzani S，Rusnati M，Riboldi E et al．Dendritic cell-endothelial cell cross-talk in angiogenesis ［J］．Trends Immunol，2007;28(9):385-392．

10 Bennaceur K，Chapman J，Brikci-Nigassa L et al．Dendritic cells dysfunction in tumour environment［J］．Cancer Lett，2008;272(2):186-196．

11 Lissoni P，Malugani F，Bonfanti A et al．Abnormally enhanced blood concentrations of vascular endothelial growth factor(VEGF)in metastatic cancer patients and their relation to circulating dendritic cells，IL-12 and endothelin-1［J］．J Biol Regul Homeost Agents，2001;15(2):140-144．

12 Ohm J E，Shurin M R，Esche C et al．Effect of vascular endothelial growth factor and FLT3 ligand on dendritic cell generation in vivo［J］．J Immunol，1999;163(6):3260-3268．

13 Michielsen A J，Hogan A E，Marry J et al．Tumour tissue microenvironment can inhibit dendritic cell maturation in colorectal cancer［J］．PLoS One，2011;6(11):e27944．

14 Huang A，Gilmour J W，Imami N et al．Increased serum transforming growth factor-beta1 in human colorectal cancer correlates with reduced circulating dendritic cells and increased colonic Langerhans cell infiltration ［J］．Clin Exp Immunol，2003;134(2):270-278．

15 Ma Y，Shurin G V，Gutkin D W et al．Tumor associated regulatory dendritic cells［J］．Semin Cancer Biol，2012;22(4):298-306．