陳 勇 李 萍 張予超 雷 清 蔣 琳

(國藥集團(tuán)蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，蘭州730046)

瘧疾是通過蚊叮咬傳播的寄生蟲病，其病原體為瘧原蟲。pfs25蛋白質(zhì)是位于惡性瘧原蟲子孢子囊表面的膜蛋白，該蛋白質(zhì)在實驗動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體以阻斷動合子的形成，是傳播阻斷型瘧疾疫苗的候選靶抗原。美國NIH以pfs25蛋白質(zhì)作為抗原制備的疫苗已經(jīng)完成I期臨床試驗。

制備針對pfs25蛋白質(zhì)的單克隆抗體，進(jìn)而建立ELISA檢測方法是研制基于pfs25蛋白的阻斷型瘧疾疫苗所必需的。本研究中，作者嘗試用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化的方式獲得pfs25蛋白純品，免疫小鼠。用熒光光譜分析、酶聯(lián)免疫吸附實驗，分析了純化過程中，pfs25蛋白的構(gòu)像與免疫原性間的關(guān)系，并對引起免疫原性改變的原因進(jìn)行了初步的探討。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量購自GE公司。抗pfs25單克隆抗體4B7和標(biāo)準(zhǔn)pfs25蛋白由美國MR4惠贈;HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG購自Sigma公司;pfs25/pGAPZαA/GS115重組酵母菌為本室構(gòu)建;多功能酶標(biāo)儀Spectra Max M2e(MD公司)。硫酸銨及其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1．2 實驗方法

1．2．1 pfs25/pGAPZαA/GS115 重組酵母菌表達(dá)pfs25蛋白質(zhì)［1］挑取陽性酵母重組菌 pfs25/pGAPZαA/GS115轉(zhuǎn)接到3 ml BMGY液體培養(yǎng)基中，20 ml三角瓶，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)，每隔24小時取樣，8 000 r/min離心 3分鐘，取上清－20℃保存。目的基因表達(dá)時間截止到96小時。陰性對照菌株pGAPZαA/GS115同步培養(yǎng)并留樣。

1．2．2 聚丙烯酰胺凝膠電泳純化pfs25蛋白質(zhì)及小鼠免疫 用6 000 r/min，15分鐘離心重組菌的培養(yǎng)液，收集上清，加入硫酸銨至80%飽和度，4℃鹽析，12小時。8 000 r/min，30分鐘離心收集沉淀的蛋白質(zhì)，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE制備電泳，分離膠的濃度為10%，濃縮膠的濃度為5%，考馬斯亮藍(lán)染色。刀片切除目的蛋白質(zhì)條帶，搗碎后加到垂直電泳管中。以50 mmol/L Tris-HCl，pH7．4 作為電泳緩沖液，120V電泳2小時。將純化的pfs25蛋白質(zhì)，以2．5 μg/只的劑量接種NIH小鼠，免疫程序:0、2、4周。

1．2．3 間接ELISA 三針免疫后一個月采集小鼠血樣，用間接 ELISA檢測血清抗體。即用 0．1 mol/L(pH9．6)的碳酸氫鈉緩沖液10倍稀釋小鼠血清后，4℃過夜;以含20%牛血清的0．02 mol/L PBS 37℃封閉1小時;依次加入pfs25單抗4B7、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG，其它按常規(guī)操作。TMB顯色后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測其450 nm/630 nm雙波長OD值。

1．2．4 雙抗體夾心 ELISA［2］在用 2 μg/ml 的pfs25單抗4B7包被板中，加入電泳純化的pfs25蛋白，濃度為 1．0 μg/ml，37℃，1．5 小時;洗板后，加入2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記pfs25單抗1B4作為二抗，37℃反應(yīng)1小時;洗板后，TMB顯色后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測其450 nm/630 nm雙波長OD值。1．2．5 熒光光譜實驗 用 pH7．4，50 mmol/L Tris-HCl溶解pfs25標(biāo)準(zhǔn)蛋白和電泳純化的pfs25蛋白，濃度為0．1 mg/ml。用多功能酶標(biāo)儀將以上兩種pfs25蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熒光光譜測定，以280 nm的激發(fā)光激發(fā)，記錄樣品在300～550 nm之間的發(fā)射光譜。

2 結(jié)果

2．1 聚丙烯酰胺凝膠電泳純化pfs25蛋白質(zhì) 首先按照文獻(xiàn)［1］成功地進(jìn)行了pfs25重組蛋白的表達(dá)，對表達(dá)的培養(yǎng)基上清進(jìn)行80%飽和度硫酸銨沉淀后，pfs25蛋白得到了有效的濃縮。通過凝膠電泳純化后，獲得了純度為93%的pfs25蛋白質(zhì)純品，結(jié)果見圖1。

2．2 ELISA分析 采用雙抗體夾心ELISA方法分析了電泳純化的pfs25蛋白。圖2的結(jié)果表明，電泳純化的pfs25蛋白與抗體呈明顯的陽性反應(yīng)，這證明了制備電泳的純化方式保留了該蛋白的抗原性。采用了間接ELISA方法分析了pfs25免疫小鼠的血清抗體效價，在對受試小鼠血清稀釋10倍后，ELISA結(jié)果陰性(結(jié)果未列)。這說明經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化pfs25蛋白質(zhì)已經(jīng)喪失了其免疫原性。

圖1 SDS-PAGE分析重組pfs25蛋白質(zhì)Fig．1 Analysis of recombinant pfs25 protein by SDS-PAGE

圖2 雙抗體夾心ELISA檢測電泳純化的pfs25蛋白Fig．2 Isolated pfs25 protein was identified by ELISA

圖3 pfs25蛋白質(zhì)在280 nm激發(fā)波長的熒光光譜Fig．3 Fluorescence emission spectra of pfs25 protein excited at 280 nm

2．3 熒光光譜 對pfs25標(biāo)準(zhǔn)品和經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化的pfs25蛋白質(zhì)同時進(jìn)行熒光光譜分析。如圖3所示，pfs25標(biāo)準(zhǔn)品在25℃時，自身熒光強(qiáng)度最高。凝膠純化電泳的pfs25蛋白質(zhì)熒光響應(yīng)，60℃時高于120℃，表現(xiàn)出對溫度的負(fù)相關(guān)。同時也可以看到，由這兩種蛋白質(zhì)制備的三個樣品，均在320～350 nm之間存在最高的熒光信號。

3 討論

聚丙烯酰胺凝膠電泳是在上世紀(jì)六十年代應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究，是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。但在單克隆抗體制備或生物藥物研發(fā)的早期摸索階段，尤其是抗原來源困難的情況下，利用SDS-PAGE電泳作為蛋白質(zhì)純化手段，已在很多研究中得到應(yīng)用［3-6］，這主要是利用了電泳純化目標(biāo)蛋白質(zhì)的快速、簡便和有效的特點。但是，該方法的最大缺陷就是操作過程中造成的目標(biāo)蛋白的變性。所以，該方法僅適合化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)分子中能發(fā)射熒光的三種氨基酸殘基為色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。其中，Trp在280～290 nm的激發(fā)光下，發(fā)射的熒光強(qiáng)度最大。本研究中的目標(biāo)蛋白質(zhì)pfs25，由171個氨基酸組成，其中，不含有Trp，僅含3個 Tyr和3個Phe。能夠產(chǎn)生熒光的氨基酸僅占pfs25蛋白總體的3．5%(6/171)，若按照20種氨基酸的平均組成計算，3種氨基酸(Trp、Tyr和 Phe)應(yīng)該有:3 ×(171 × 0．05)=25．65個，顯然，pfs25蛋白是一種自身產(chǎn)生熒光很弱的蛋白質(zhì)。由于該蛋白的一級序列中不存在熒光強(qiáng)度最大的色氨酸，就造成了該蛋白在280 nm處熒光強(qiáng)度很低，即在熒光光譜分析中標(biāo)準(zhǔn)pfs25的熒光強(qiáng)度也達(dá)不到200單位。此外，該蛋白質(zhì)雖然不大，但在三維結(jié)構(gòu)上，卻包含9對二硫鍵，四個“EGF樣結(jié)構(gòu)域”。以上結(jié)構(gòu)組成使得pfs25蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)極為致密，肽鏈的扭曲程度高。通過SWISS-MODEL軟件模擬的pfs25蛋白的空間結(jié)構(gòu)分析，可以看出多數(shù)酪氨酸和苯丙氨酸位于分析內(nèi)部的疏水區(qū)域，這樣的分布有利于穩(wěn)定熒光生色基團(tuán)。而通過電泳純化后的pfs25蛋白質(zhì)中，空間分子結(jié)構(gòu)趨于解離，這造成熒光產(chǎn)生氨基酸受到保護(hù)的疏水區(qū)域被破壞，使得酪氨酸和苯丙氨酸過多地暴露在溶劑中，降低了熒光強(qiáng)度。從熒光光譜分析中也可以看出，電泳純化的pfs25蛋白在經(jīng)過了120℃的加熱處理后，熒光強(qiáng)度僅為標(biāo)準(zhǔn)品的30%。

本研究中，經(jīng)電泳分離的畢赤酵母重組表達(dá)的pfs25蛋白質(zhì)免疫小鼠后，受試動物沒有獲得預(yù)期的免疫效果，小鼠血清抗體陰性。初步認(rèn)為:經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳純化pfs25蛋白質(zhì)雖保留了原蛋白的抗原的反應(yīng)性，但喪失了免疫原性。對此，作者認(rèn)為在電泳純化pfs25蛋白質(zhì)的樣品制備過程時，加熱和SDS的理化作用導(dǎo)致了該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變和表位的破壞，喪失了其免疫原性。Wu的研究也表明［7］，天然pfs25蛋白自身的免疫原性就不強(qiáng)，也從側(cè)面證實了電泳分離的pfs25蛋白可能喪失免疫原性。

不同的蛋白質(zhì)抗原，因性質(zhì)差異在理化處理后可能對其免疫原性有不同的影響。在經(jīng)過同樣的高溫處理后的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，前者的免疫原性完全喪失，而β-伴大豆球蛋白的免疫原性卻僅是稍微下降［8］?？梢姷鞍踪|(zhì)的免疫原性對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征有很強(qiáng)的要求，尤其是空間構(gòu)像。此外，抗全長 Tat蛋白血清可以與艾滋病毒Tat蛋白N末端合成肽反應(yīng)性，并非所有含N末端的 Tat抗原都能夠誘導(dǎo)抗該區(qū)抗體［9］。同時，免疫原性是在整體動物水平進(jìn)行的，影響實驗的因素大為增加。而對于蛋白質(zhì)的抗原性，只要保持與特異性抗體反應(yīng)的氨基酸組成，ELISA檢測多表現(xiàn)為陽性結(jié)果。況且，抗原性的檢測通常是在體外進(jìn)行，反應(yīng)的可控性強(qiáng)，干擾因素較少。

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