梁濤 劉珂鳳 何宏 趙桂秋 王婷 喻文倩

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，青島 266003;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，青島 266003)

真菌性角膜炎是一種世界范圍的角膜感染性疾病，致盲率極高，治療一直較為棘手。在目前臨床上常用的眼部抗真菌藥物在不同程度上具有抗菌譜窄、穿透力差、毒副作用較大等缺點(diǎn)，治療效果并不十分理想。因此，確定真菌的毒力因子、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)已經(jīng)成為抗真菌基礎(chǔ)研究和研制新型抗真菌藥物的首要環(huán)節(jié)。以往此類研究常用的方法是基因敲除，然而由于茄病鐮刀菌等絲狀真菌中同源重組的效率極低，基因敲除的效果并不理想［1］。RNA干擾是一種通過雙鏈小分子RNA(dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，利用RNA干擾誘導(dǎo)的RNA沉默已經(jīng)成功用于癌癥、病毒感染的治療，其效果遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的基因或抗體的阻斷性治療。我們通過制備RNA干擾載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌孢子并對ALP沉默菌株ALP轉(zhuǎn)錄水平及酶活性進(jìn)行檢測，以期獲取ALP基因沉默菌株，為將來進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究真菌侵襲機(jī)制提供有利條件。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要培養(yǎng)基

標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮孢菌株 (Fusarium solani)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院真菌中心提供，編號:CMCC(F)B24c;JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存;真菌沙氏(Sabouraud)培養(yǎng)基、2%麥芽糖肉湯液體培養(yǎng)基、YED、LB液體培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司;蛋白瓊脂廓清率特殊培養(yǎng)基 (包括瓊脂1.5 g、葡萄糖 2.7 g、氯霉素 0.01 g、無菌去離子水 100 mL 加入甘氨酸 13 mmol/L、KH2PO429.4 mmol/L、MgSO410 mmol/L、維生素 B13 μmol/L、pH4.5 偶氮白蛋白 0.1 g。)

1.2 方法

雙鏈RNA干擾 (RNAi)的載體質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)Pubmed Genebank中檢索到的茄病鐮刀菌ALP(序列號S71812)的保守區(qū)域RNA干擾部位，設(shè)計(jì)ALP功能域的長度分別為498 bp、531 bp兩個(gè)序列作為干擾片段。設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的兩套引物，通過一系列PCR擴(kuò)增和雙酶切將其正反向序列插入載體質(zhì)粒pBC-hygro(由法國Institut de Génétique et Microbiologie Philippe Silar教授惠贈)中，中間隔以250 bp的GFP序列形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了載體質(zhì)粒pALP1和pALP2(見表1～2)。

表1 擴(kuò)增引物1Tab.1 Amplification primers 1

表2 擴(kuò)增引物2Tab.2 Amplification primers 2

載體質(zhì)粒pALP1和pALP2構(gòu)建的PCR擴(kuò)增體系 以提取的茄病鐮刀菌和GFP基因作為模板，分別以引物X-1至X-6、X-7至X-12依次進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增，部分PCR反應(yīng)體系如下。

Ⅰ用引物X-1和X-2，以茄病鐮刀菌基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段命名為X-A。PCR反應(yīng)體系見表3。

表3 PCR反應(yīng)體系Tab.3 PCR reaction system

反應(yīng)條件為:第一步，94℃ 7 min;第二步，94℃1 min，58℃ 45 s，72℃ 50 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);第三步，72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、割膠回收，備用。

Ⅱ用X-3和X-4為引物，以GFP基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段命名為X-B。PCR反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件為:第一步，94℃ 7 min;第二步，94℃ 1 min，57℃ 30 s，72℃ 45 s，共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán);第三步，72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、割膠回收，備用。

1.3 測序

將所構(gòu)建質(zhì)粒載體pALP1、pALP2送北京博邁德科技發(fā)展公司進(jìn)行測序。

1.4 構(gòu)建的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌及抗性篩選

分別將攜帶有pALP1、pALP2的JM109大腸桿菌接種至含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。提取單克隆陽性質(zhì)粒，備轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌孢子用。將生長于Sabouraud培養(yǎng)基中的茄病鐮刀菌1.0×107spores/mL接種于YED液體培養(yǎng)基中。采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法對茄病鐮刀菌孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，參 照 Mukherjee 方 法 略 加 改 進(jìn)［2］，配 制PEG4000-LiAc培養(yǎng)液。將分生孢子懸液與pALP1和pALP2混勻后經(jīng)過一系列處理后加600 μL 0.1M(pH6.0)的醋酸鋰;涂布于含有潮霉素B(終濃度為200 μg/mL)選擇性培養(yǎng)基平板上28℃培養(yǎng)。挑取單個(gè)陽性菌落涂布于潮霉素B(終濃度為200 μg/mL)抗性的 Sabouraud培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，36 h后觀察結(jié)果。所獲菌株命名為 ΔALP1、ΔALP2。

1.5茄病鐮刀菌ALP基因沉默后轉(zhuǎn)錄水平的檢測

提取鐮刀菌總RNA［3］，RT-PCR檢測茄病鐮刀菌ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，設(shè)計(jì)合成引物見表4。

表4 設(shè)計(jì)合成引物Tab.4 The designed primers

進(jìn)行一步法 RT-PCR，反應(yīng)條件為:42℃，50 min;95℃，5 min;94℃，30 s;58℃，45 s;72℃，45 s;32個(gè)循環(huán);72℃，7 min，重復(fù)3次。以茄病鐮刀菌18s rRNA為內(nèi)參照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳后于UNIUER SAL HooD-S.N.75s凝膠成像分析系統(tǒng)分析，分別對電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，得到各條帶的峰面積積分值，計(jì)算它們與18s rRNA比值獲得校正值。

1.6 RNA干擾后茄病鐮刀菌ALP酶活性檢測

參照文獻(xiàn)［4］制作含有0.1%偶氮白蛋白的蛋白瓊脂廓清特殊培養(yǎng)基，按等邊三角形選取3個(gè)點(diǎn)，各滴加 10 μL標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮刀菌、ΔALP1和ΔALP2孢子懸液，每菌株接種6個(gè)平皿，30℃培養(yǎng)12 d。含有偶氮白蛋白，培養(yǎng)基略呈橙黃色。茄病鐮刀菌分泌的ALP可水解培養(yǎng)基底物中的偶氮白蛋白，菌落周圍培養(yǎng)基中的偶氮白蛋白在被水解后逐漸形成透明的暈環(huán)(廓清環(huán))，因此可以通過測量廓清環(huán)的大小檢測茄病鐮刀菌ALP的活性。CH值的計(jì)算參照Price法［5］:CH=菌落半徑/(菌落半徑+廓清環(huán)半徑)。CH值越小，表明真菌蛋白酶分泌量越多、活性越強(qiáng);CH值越大表明蛋白酶分泌量越小、活性越弱，真菌毒力越低。于接種后第12 d測量各菌株CH值，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用(±s)表示。采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間差異用單因素方差分析 (one-way ANOVA)和q檢驗(yàn)。取P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)意義，P＜0.01為差別有顯著統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA干擾載體質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建載體質(zhì)粒pALP1和pALP2，提取陽性質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，各插入序列測序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致。

2.2 基因沉默茄病鐮刀菌轉(zhuǎn)錄水平 ΔALP2、ΔALP2 mRNA的檢測

以標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮刀菌為對照，RT-PCR對ΔALP1、ΔALP2菌株ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。半定量分析顯示，ΔALP1菌株ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平為標(biāo)準(zhǔn)菌株的 42.77%(1.248/2.918)，ΔALP2菌株ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平僅為標(biāo)準(zhǔn)菌株的69.57%(2.030/2.918)，兩者較標(biāo)準(zhǔn)菌株差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=184.67，q=10.379～26.943，P＜0.01)，結(jié)果詳見表5。

表5ΔALP1、ΔALP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化(x珋±s)Tab.5 The changes of ΔALP1 and ΔALP2 gene transcription(珋x ± s)

2.3 RNA干擾后茄病鐮刀菌ALP酶活性檢測結(jié)果

接種于含有偶氮白蛋白的特殊培養(yǎng)基上的標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮孢菌、ΔALP1和ΔALP2菌株30℃培養(yǎng)12 d后，菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明廓清環(huán)，各株菌落直徑大致相同，ΔALP2株的廓清環(huán)明顯小于標(biāo)準(zhǔn)菌株與ΔALP1株，其CH值與后兩者比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=5.276、5.463，P＜0.01)，結(jié)果詳見表6。

表6ΔALP1、ΔALP2菌株ALP酶活性的變化(x珋±s)Tab.6Changes of△ALP1 and△ALP2 enzymatic activities(x珋±s)

3 討 論

真菌性角膜炎病情嚴(yán)重，鐮刀菌和曲霉菌是我國主要的眼部致病真菌，其中大部分地區(qū)以鐮刀菌為主。研究顯示該菌引起的角膜炎預(yù)后更差，易導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害［6-7］。因此，對鐮刀菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究具有很重要的意義。RNA干擾是指在進(jìn)化過程中高度保守、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高度特異性降解的現(xiàn)象。通過該技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，目前被廣泛用于探索基因功能和疾病的基因治療領(lǐng)域。近年來，隨著大量絲狀真菌基因序列信息的測定，國內(nèi)外相關(guān)研究已陸續(xù)展開。

對真菌侵襲力的相關(guān)研究表明，真菌分泌的酶類在其感染宿主的過程中扮演著重要角色。ALP是從煙曲霉菌培養(yǎng)液中分離出的一種堿性蛋白酶，可以劈開基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)前肽鏈、使其活性中心暴露，從而使MMP-1、MMP-9等活化，目前被認(rèn)為是致病性真菌潛在的毒力因子。對煙曲霉菌肺損傷的研究顯示［8］，ALP能夠快速降解人肺組織中I型、III型膠原和纖維連接蛋白，導(dǎo)致呼吸道明顯破壞，并可在1 h內(nèi)完全降解組織切片中的層黏連蛋白。另有研究顯示［9］，茄病鐮刀菌在富有膠原的培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。但是在它們感染的角膜炎動物模型的角膜組織中僅檢測到金屬蛋白酶，而且被證實(shí)為組織中激活炎性細(xì)胞(PMN)所釋放的MMP-9，因而推測是致病真菌產(chǎn)生少量的絲氨酸蛋白酶，PMN和角膜細(xì)胞釋放大量的MMP-9，進(jìn)而導(dǎo)致角膜基質(zhì)降解［10］，目前其他角膜致病真菌尚未見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)針對茄病鐮刀菌ALP基因構(gòu)建RNA干擾載體質(zhì)粒，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌孢子，結(jié)果顯示，經(jīng)RNA干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，基因沉默株ΔALP1、ΔALP2ALPmRNA轉(zhuǎn)錄水平較標(biāo)準(zhǔn)菌株分別下降了42.77%和69.57%，顯示基因沉默菌株mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)。對RNA干擾后基因沉默菌株酶活性檢測結(jié)果顯示，各基因沉默株相應(yīng)ALP對底物分解能力受到了不同程度的抑制，酶活性均有明顯下降，這提示我們干擾后的茄病鐮刀菌株的毒力有可能減弱。從酶活性檢測結(jié)果看，ΔALP2株的廓清環(huán)明顯小于標(biāo)準(zhǔn)菌株與ΔALP1株，其CH值與后兩者比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=5.276、5.463，P＜0.01)。綜合mRNA和酶活性分析兩者檢測結(jié)果，ΔALP2菌株所取得的基因沉默效果更佳。ALP基因沉默茄病鐮刀菌株的獲取將有助于深入研究鐮刀菌的基因功能，對與茄病鐮刀菌侵襲性相關(guān)的基因進(jìn)行有針對性的單一干預(yù)操作可為闡明真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制、尋找嶄有效的治療措施開辟新的途徑。

［1］Mouyna I，Sarfati J，Recco P，et al.Molecular characterization of a cell wall-associated beta(1-3)endoglucanase ofAspergillus fumigatus［J］.Med Mycol，2002，40(5):455-464.

［2］Mukherjee PK，Seshan KR，Leidich SD，et al.Reintroduction of the PLB1 gene intoCandida albicansrestores virulence in vivo［J］.Microbiology，2001，147(Pt9):2585-2597.

［3］梁濤.RNA干擾曲霉菌ALP、PLB基因表達(dá)治療真菌性角膜炎的實(shí)驗(yàn)研究［D］.青島:青島大學(xué)眼科學(xué)，2010.

［4］徐赤宇，溫海，王溪濤，等.新型隱球菌的細(xì)胞外蛋白水解酶及絲氨酸蛋白酶活性檢測［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(2):125-128.

［5］Price MF，Wilkinson ID，Gentry LO.Plate method foe detection of phospholipase activity inCandida albicans［J］.Sabouraudia，1982，20(1):7-14.

［6］王麗婭，張?jiān)虑?，王印其，?中國三地區(qū)真菌性角膜病致病菌種的調(diào)查［J］.中華眼科雜志，2000，36(2):8-12.

［7］賀燚，孫秉基，趙東卿，等.真菌性角膜炎的臨床特征及療效觀察［J］.中華眼科雜志，2000，36(5):358-361.

［8］Iadarola P，Lungarella G，Martorana PA，et al.Lung injury and degradation of extracellular matrix components byAspergillus fumigatusserine proteinase［J］.Exp Lung Res，1998，24(3):233-251.

［9］Zhu WS，Wojdyla K，Donlon K，et al.Extracellular proteases ofAspergillus flavus.Fungal keratitis，proteases，and pathogenesis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，1990，13(6):491-497.

［10］Gopinathan U，Ramakrishna T，Willcox M，et al.Enzymatic，clinical and histologic evaluation of corneal tissues in experimental fungal keratitis in rabbits［J］.Exp Eye Res，2001，72(4):433-442.