郭建偉，董嘉文，孫敏華，李林林，袁建峰，吳玄光，胡奇林*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)屬于黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病毒，是DTMUV病的病原[1-3]。DTMUV病于2010年在華東地區(qū)首次發(fā)生，已蔓延至全國(guó)各地的養(yǎng)禽場(chǎng)。該病毒能夠感染鴨、鵝和雞[4-5]，蛋鴨發(fā)病后，臨床上以病鴨厭食、排稀便、產(chǎn)蛋量急劇下降甚至停止，卵泡出血，變性，壞死為主要特征，其發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率為5%～10%[1-2]，開展該病深入的流行病學(xué)研究具有重要的經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生意義。目前，適用于該病大規(guī)模血清流行病學(xué)研究的方法只有用純化的全病毒抗原建立的間接ELISA方法[6]，但由于該方法采用全病毒抗原，具有潛在散毒的危險(xiǎn)，同時(shí)成本高。因此，迫切需要建立一種更加安全、成本低廉的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方法。

DTMUV的基因組為不分節(jié)段的具有感染性的單股正鏈RNA，長(zhǎng)度為10990個(gè)核苷酸，順序?yàn)?'-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-N S5-UTR-3'。DTMUV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1由404個(gè)氨基酸組成[7]，具有保守性和抗原性。迄今為止，未見DTMUV NS1克隆表達(dá)的報(bào)道。本研究將DTMUV NS1基因克隆到pET32a(+)載體，在Rosetta中表達(dá)，獲得重組表達(dá)的DTMUV NS1，為DTMUV病的診斷和血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒和菌株 DTMUV JM株及其抗血清，為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所禽病研究室分離鑒定、制備和保存；陽(yáng)性血清是采自本實(shí)驗(yàn)室用DTMUV分離株感染DTMUV陰性鴨耐過后28d的血清。

1.2 主要試劑及質(zhì)粒 RNA抽提試劑盒、Bam HⅠ、Hin dⅢ、T4DNA連接酶、DNA Marker、pMD18-T Simple購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Fermentas公司；兔抗鴨IgG購(gòu)自Nordic公司；OPD購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；大腸桿菌工程菌株DH5α、Rosetta、pET32a(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中DTMUV NS1基因序列(JF312912)設(shè)計(jì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1065bp，引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5'-TATGGATCCGACACG GGGTGCTCAA-3'(Bam HⅠ)；下游引物：5'-CCC AAGCTTAGCCATGACCTTT GATTT-3'(Hin d Ⅲ)。

1.4 DTMUV NS1基因的擴(kuò)增 參照RNA抽提試劑盒操作說明提取DTMUV RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10m in。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 NS1擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 將擴(kuò)增的NS1基因與pMD18-T-simple載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行Bam HⅠ、Hin dⅢ雙酶切及PCR鑒定，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序并將重組質(zhì)粒命名為pMD18TNS1。

1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將pMD18T-NS1經(jīng)Bam HⅠ、Hin dⅢ雙酶切后的目的片段與經(jīng)同樣酶切的pET32a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并命名為pET32a-NS1。

1.7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白可溶性分析 將pET32a-NS1轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)至OD600nm達(dá)0.5～0.8，加IPTG至終濃度為1.0mmol/L，37℃誘導(dǎo)3h，進(jìn)行SDS-PAGE分析。用超聲儀破碎菌體，分離上清和沉淀，分別進(jìn)行12%SDSPAGE分析表達(dá)蛋白的可溶性。

1.8 重組蛋白的提取及純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌用超聲波裂解，離心，棄去上清，加15m L Binding Buffer重懸菌體，冰浴2h，4℃ 11000r/min離心20m in，收集上清，得溶解的包涵體。按Novagen公司的Ni-NTA His.Bind樹脂說明書對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，進(jìn)行濃縮，bradford方法測(cè)定蛋白濃度。

1.9 Western blot檢測(cè) 表達(dá)的NS1重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)印至NC膜。以1∶50倍稀釋的DTMUV陽(yáng)性血清為一抗，1∶5000HRP標(biāo)記的羊抗鴨IgG為二抗，用DAB顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 DTMUV NS1基因RT-PCR PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，獲得了一條約1100bp的特異性片段，與預(yù)期大小(1065bp)一致(圖1)。

2.2 pET32a-NS1的鑒定 pET32a-NS1經(jīng)酶切鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致。并將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比較，結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的片段與參考基因的核苷酸序列同源性為99%。

2.3 陽(yáng)性重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白可溶性分析

pET32a-NS1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，在約59ku出現(xiàn)一條特異性蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白分子量大小一致(圖2)。誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌經(jīng)超聲裂解后，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體形式存在。

2.4 NS1重組蛋白western blot檢測(cè) 用DTMUV陽(yáng)性血清對(duì)該重組蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，在約59ku處有一條特異條帶，表明NS1重組蛋白能夠與DTMUV陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，證明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性(圖3)。

NS1是DTMUV的非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能尚不清楚。而黃病毒科登革病毒(DENV)的NSl是DENV非結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的糖蛋白，是唯一能夠在感染細(xì)胞表面表達(dá)和分泌到胞外的非結(jié)構(gòu)蛋白，高度保守，含有群特異性和型特異性決定簇，具有多種T和B細(xì)胞抗原表位，能夠誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，檢測(cè)血清中NS1水平可以用于DENV感染的早期診斷和分型診斷[8]。針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體只在病毒感染的宿主中存在，而在經(jīng)滅活疫苗免疫的動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)不到，從而可以區(qū)別感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物[9]。因此，開展DTMUV NS1的表達(dá)研究，將為建立能夠區(qū)別DTMUV感染的動(dòng)物和滅活疫苗免疫動(dòng)物的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，對(duì)該病的防控及凈化具有重要意義。

本研究為研制能夠區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物的安全、成本低廉的血清學(xué)檢測(cè)方法和試劑奠定了基礎(chǔ)，對(duì)該病的有效防制具有重要意義。

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