劉啟生，王振寶，王 真，哈 森，張玉婷，巴音查汗*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊830052；2.伊犁出入境檢驗檢疫局，新疆伊犁835000)

牛巴貝斯蟲(Babesia bovis)是一種蜱媒血液原蟲，牛屬動物感染后，出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、血紅蛋白尿、共濟失調(diào)等癥狀，嚴重時引起死亡，給畜牧業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[1]。B.bovis與雙芽巴貝斯蟲(B.bigem ina)、牛環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)等梨形蟲(牛焦蟲)常?；旌细腥九Ｖ?，嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展[2-3]，梨形蟲的混合感染和隱性感染對牛血液原蟲病的防治帶來了一定困難。

目前，國外學者對B.bovis進行分子生物學檢測的報道較多，常規(guī)PCR、套式PCR和基于SYBR Green染料的實時熒光PCR在B.bovis的檢測方面均有應用[4-6]。常規(guī)PCR存在靈敏度低，檢測周期較長等缺點；套式PCR靈敏度高，但兩步的PCR反應繁瑣、易污染，不適用于大規(guī)模的流行病學調(diào)查；實時熒光PCR技術(shù)敏感性高、特異性強、檢測速度快，與常規(guī)PCR相比不存在交叉污染和核酸染料對人體的危害等缺點，近年來逐漸應用于各種病原體的定性檢測[7-10]。本研究建立檢測B.bovis的實時熒光PCR方法，為B.bovis的早期、快速檢測，梨形蟲病的防控及分子流行病學研究提供了一種新的檢測手段。

1 材料和方法

1.1 標準蟲株 B.bovis、B.bigemina蟲株由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供；T.annulata蟲株由本實驗室分離保存。

1.2 主要試劑 全血DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DL2000Marker、膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物與探針 通過比對GenBank中B.bovis 18S rRNA基因的保守序列，使用PrimerPrim ier5和Primer Express 3.0軟件設計一對引物和一條探針：BboF：5'-GTGTTTCAAGCAGGTTTCGC-3'； BboR： 5'-CGT GCGTCATCGACAAATCT-3'； BboP： 5'-FAM-TGAG CATGGAATAACCTTGTATGACCCT-TAMRA-3'，目的片段大小為160bp。引物和探針均由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 蟲體DNA提取及標準品制備 采用全血DNA提取試劑盒提取B.bovis DNA，應用特異性引物進行常規(guī)PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段連接至pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒并由北京鼎國生物技術(shù)有限公司測序，將鑒定正確的重組質(zhì)粒作為標準陽性模板并測定濃度。

1.5 熒光定量PCR反應體系和反應條件的優(yōu)化以標準品為模板，對Mg2+、dNTPs、引物、探針退火延伸溫度和時間進行優(yōu)化。

1.6 標準曲線的建立和敏感性試驗 將標準陽性重組質(zhì)粒經(jīng)微量核酸蛋白分析儀測定濃度，用TE緩沖液稀釋成10倍系列梯度濃度(1.31×108copies/μL～1.31×100copies/μL)作為模板，于-20℃保存。按優(yōu)化好的體系條件進行實時熒光PCR，繪制標準曲線。同時以上述梯度濃度模板進行常規(guī)PCR試驗，比較兩者的靈敏度。

1.7 特異性試驗 提取B.bovis、B.bigem ina、T.annulata和健康牛血的DNA作為模板，用雙蒸水做為空白對照，進行實時熒光PCR擴增，評價試驗的特異性。

1.8 穩(wěn)定性試驗 取4個不同濃度的樣品作為模板進行重復性試驗，每個濃度做4個平行，重復3次。收集數(shù)據(jù)，計算組內(nèi)、組間變異系數(shù)，評價試驗的穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測 從分別采自吐魯番、伊犁的23份疑似病例血液樣品提取DNA，進行實時熒光PCR檢測，同時對樣品進行常規(guī)PCR檢測，評價實時熒光PCR的臨床應用性。

2 結(jié) 果

2.1 陽性模板的鑒定 以B.bovis DNA為模板經(jīng)常規(guī)PCR反應，擴增的目的片段與預期(160bp)一致(圖1)，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)測序比對，與GenBank中登錄的B.bovis18S rRNA基因序列的同源性達到98%～100%。

2.2 熒光定量PCR反應體系和條件的確定 經(jīng)優(yōu)化建立如下反應體系：10×PCR buffer(Mg2+free)2.5μL，MgCl2(25mmol)3.5μL，dNTPs(10mmol)0.5μL，BboF/BboR(10μmol)各 1μL，Taq Man探針(10μmol)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5u/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，加滅菌雙蒸水至25μL。反應條件為：95℃ 2m in；95℃ 10s、55℃ 60s，45個循環(huán)；每個循環(huán)延伸結(jié)束時采集熒光信號。

2.3 標準曲線及實時熒光PCR靈敏度 以10倍系列梯度濃度(1.31×108copies/μL～1.31×100copies/μL)的陽性重組質(zhì)粒作為模板進行實時熒光PCR反應，濃度為1.31×101copies/μL時依然有擴增曲線(圖 2)。模板濃度與CT值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，回歸方程為：CT=-3.346lg(X)+43.50。擴增效率為99%，符合實時熒光PCR的試驗預期結(jié)果。常規(guī)PCR的檢測濃度下限為1.31×104copies/μL(圖3)，靈敏度遠低于實時熒光PCR。

2.4 特異性試驗 應用實時熒光PCR進行特異性試驗顯示，B.bovis出現(xiàn)特異性的擴增曲線，B.bigemina、T.annulata、健康牛血和空白對照均未產(chǎn)生特異性熒光信號。結(jié)果表明建立的實時熒光PCR具有良好的特異性(圖4)。

2.5 穩(wěn)定性試驗 選取 1.31×108copies/μL、1.31×106copies/μL、1.31×104copies/μL、1.31×102copies/μL 4個濃度的陽性模板進行組內(nèi)和組間重復性試驗，計算出組內(nèi)組間CT值的變異系數(shù)分別為0.35%～1.70%、0.32%～0.60%(表1)，均小于3%，表明該方法具有良好的重復性。

表1 實時熒光PCR的重復性試驗Table 1The reproducibility test of real-time PCR

2.6 臨床樣品的檢測 將23份臨床全血樣品分別應用實時熒光PCR和常規(guī)PCR進行檢測，結(jié)果顯示，實時熒光PCR能夠檢出12份陽性，常規(guī)PCR只檢出7份陽性，并且常規(guī)PCR檢出的7份陽性樣品熒光PCR均顯示為陽性，實時熒光PCR和常規(guī)PCR的檢出率分別為52.17%和30.43%，表明該實時熒光PCR有良好的臨床靈敏性和應用性。

3 討論

目前，牛巴貝斯蟲病的診斷一般為血涂片鏡檢，該方法雖然方便直觀，但敏感性差，檢出率低，對低水平感染檢測不能適用；間接熒光抗體試驗(IFAT)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等血清學方法應用較為廣泛，但存在不能區(qū)分耐過動物、不易區(qū)分相近蟲種的交叉感染的缺點[11]；實時熒光PCR方法可以直接檢測病原核酸，準確性高，對隱性感染和低水平感染具有良好的檢出率。實時熒光PCR主要分為染料法和探針法，探針法的優(yōu)勢在于在上下游引物之間引入一條與目的模板特異性結(jié)合的熒光標記探針，增強了實時熒光PCR的特異性和敏感性。本研究針對B.bovis 18S rRNA基因設計引物和Taq Man探針，建立了B.bovis實時熒光PCR檢測方法，該方法最低可以檢測1.3×101copies靶基因，對低水平感染有更好的檢出率，敏感性較常規(guī)PCR高1000倍；與其他幾種牛屬動物易感血液原蟲無交叉反應，特異性強，能夠準確快速定性檢測；組內(nèi)和組間試驗的變異系數(shù)分別為0.35%～1.70%、0.32%～0.60%，方法的穩(wěn)定性好；臨床樣品檢測表明該方法具有良好的應用性。

綜上所述，本研究建立的實時熒光PCR檢測方法，可以靈敏、特異的快速定性檢測B.bovis，該方法的建立將為蜱傳原蟲病的流行病學調(diào)查提供快速有效的檢測手段，為蜱媒病的相關(guān)研究提供有效的技術(shù)支持。

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