么乃全，高云航*，于 丹，張 敏，耿 磊，王全凱*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林長春130118；2.長春市動物疫病預防控制中心，吉林長春130061；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

鴨疫里氏桿菌病是目前影響?zhàn)B鴨業(yè)最為嚴重的細菌性傳染病，在世界各養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎均有流行，尤其在鴨飼養(yǎng)密度高的東南亞地區(qū)，發(fā)病情況尤為嚴重[1]。控制該病最有效的措施是全菌體滅活油佐劑疫苗免疫預防，對同血清型菌攻毒保護率可達100%[2]。但因其病原鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)血清型眾多及血清型間缺乏交叉保護，限制了滅活油佐劑苗的應(yīng)用，因此開發(fā)RA的亞單位疫苗成為解決此問題的關(guān)鍵。Camp是一種唾液酸糖蛋白，具有促進溶血素溶血功能的作用，已被初步證明是RA可能的毒力因子，并且在各血清型菌間具有很高的同源性和保守性，在部分血清型菌株間具有反應(yīng)原性[3]。為評價該蛋白用于亞單位疫苗開發(fā)及診斷的潛在價值，本研究以吉林奧白星鴨分離鑒定的JL-1RA的DNA為模板，克隆camp基因并進行原核表達，利用western blot進一步驗證該Camp是眾多血清型RA菌株共有的具有良好反應(yīng)原性和免疫原性蛋白；同時以Camp表達蛋白為包被抗原建立間接ELISA檢測方法，為鴨RA的流行病學調(diào)查、亞單位疫苗的開發(fā)提供有效的方法和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及血清 血清1型鴨RA分離自吉林某鴨場的法國奧白星鴨，命名為JL-1；血清1、2、11型RA由南京農(nóng)業(yè)大學張煒博士惠贈，血清10、17型RA由北京農(nóng)業(yè)大學蘇敬良副教授惠贈；E.coli DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)和 pET-28a、pMD18-T載體均由吉林農(nóng)業(yè)大學傳染病實驗室保存；兔抗血清1、2、10、11、17型RA全菌體陽性血清、鴨抗RA(JL-1)陽性血清、鴨E.coli、沙門氏菌(Saimonella)、巴氏桿菌(Pasteurellosis)和鴨肝炎病毒(DHV)陽性血清由本實驗室制備；待檢血清采自吉林某鴨場；SPF鴨血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 HRP標記羊抗兔、鴨HRP-IgG、DAB顯色劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、dNTP M ixture、Bam HⅠ及XhoⅠ、蛋白質(zhì)Marker和DNA Marker購自TaKaRa公司；凝膠DNA回收、質(zhì)粒小提試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的camp基因(AF202727)序列使用Primer 5.0設(shè)計一對引物，上游引物P1：5'-GCGGATCCATGAAACAAT CTATT-3'(Bam HⅠ)，下游引物 P2：5'-CGCTCGAG TTACTTTACATTTA-3'(XhoⅠ)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 camp基因的克隆及pET-camp重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以JL-1株RA基因組DNA為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。目的條帶經(jīng)凝膠DNA回收試劑盒純化回收后克隆于pMD18-T載體中，并通過Bam HⅠ和XhoⅠ進行雙酶切亞克隆于pET-28a中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-camp，將其轉(zhuǎn)化于E.coli BL21中，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序鑒定。

1.5 Cam p重組蛋白的誘導表達及純化 采用終濃度為1mmol/L的IPTG對含有陽性重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒的E.coli BL21誘導表達5h，誘導后菌體經(jīng)超聲裂解收集包涵體，經(jīng)處理后進行SDS-PAGE電泳檢測，觀察Camp蛋白表達情況。誘導表達的蛋白用電洗脫方法進行純化，SDS-PAGE電泳檢測純化效果，同時測定純化蛋白濃度。

1.6 Camp表達蛋白的western blot鑒定 純化的Camp蛋白進行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將表達蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，10%脫脂奶粉4℃封閉過夜，分別加入兔抗血清1、2、10、11、17型RA陽性血清，37℃孵育1h，以羊抗兔HRP-IgG于37℃孵育1h，DAB顯色劑顯色。

1.7 間接ELISA方法的建立

1.7.1ELISA反應(yīng)體系確立將純化的Camp表達蛋白用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋不同濃度包被酶標板，將鴨抗RA(JL-1)陽性、陰性血清倍比稀釋進行雙方陣試驗，同時對酶標二抗的稀釋度進行優(yōu)化，篩選出最佳的抗原包被濃度、血清稀釋度及酶標抗體工作濃度，確定最終的ELSIA反應(yīng)體系。同時參照文獻[4]的方法，以RA菌體超聲破碎抗原包被酶標板建立間接ELISA。

1.7.2ELISA臨界值的確定用建立的ELISA方法對經(jīng)試管凝集檢測為陰性的50份血清進行檢測，計算出陰性血清平均OD490nm值()和標準差(SD)，計算公式為+3SD，得出結(jié)果即為判定血清陰、陽性的臨界值。

1.7.3間接ELISA方法的特異性檢驗利用建立的ELSIA 方法對鴨 E.coli、Saimonella、Pasteurellosis、DHV、RA的陽性血清進行檢測，測得各自O(shè)D490nm值根據(jù)臨界值判定陰、陽性，以檢驗ELISA方法的特異性。

1.7.4間接ELISA方法重復性檢驗使用同一批制備的表達抗原對篩選的陽性和陰性血清樣本進行檢測，每個樣品設(shè)6個重復，分別進行板內(nèi)和板間重復性試驗，測得結(jié)果經(jīng)SPSS 17.0軟件分析計算板內(nèi)和板間的變異系數(shù)(CV)，以檢驗ELISA方法的重復性。

1.7.5間接ELISA方法臨床應(yīng)用及對比試驗利用建立的Camp-ELSIA及RA菌體超聲破碎ELISA方法分別檢測吉林省部分鴨場采集的240份鴨血清樣本及12份SPF鴨血清樣本，根據(jù)臨界值判定結(jié)果，統(tǒng)計兩種方法檢測血清樣本的陽性率，比較兩種方法符合率。2、10、11和17型RA全菌體陽性血清均發(fā)生特異性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 camp基因的克隆及pET-camp重組質(zhì)粒構(gòu)建應(yīng)用設(shè)計的引物以RA(JL-1)基因組DNA為模板擴增出約1000bp的目的基因片段(圖1)，與預期大小相符(1026bp)。構(gòu)建的pET-camp原核表達質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ、XhoⅠ雙酶切和PCR鑒定，均可見與目的基因大小一致片段，經(jīng)測序表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，并且目的基因與GenBank中登錄的幾株RA的camp基因序列同源性達到99%。

2.2 Cam p重組蛋白表達、純化及western blot分析 pET-camp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21中經(jīng)IPTG誘導5h后進行SDS-PAGE電泳檢測，在約37ku處可見一條清晰蛋白條帶(圖2)，與預期結(jié)果一致，表明正確表達出包涵體形式的Camp蛋白。以電洗脫方法純化目的蛋白，經(jīng)測定蛋白濃度為2.5mg/m L。同時western blot分析顯示Camp蛋白與兔抗血清1、

2.3 間接ELISA方法建立

2.3.1ELISA最佳反應(yīng)體系及臨界值確定如表1所示，經(jīng)雙方陣試驗確定Camp表達蛋白的最佳包被濃度為10μg/m L，血清最佳稀釋度為1∶100，盡管血清稀釋度1∶50時陽性血清OD490nm值最高，但陰性血清OD490nm也相對偏高。在固定抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)后確定酶標抗體工作濃度為1∶2000時陽性血清OD490nm最高，并且與陰性血清OD490nm差值最大。計算所檢測50份陰性血清OD490nm的平均值(X)和標準差(SD)分別為0.236和0.0452，經(jīng)公式計算為0.372，為所建立ELISA的臨界值。

表1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)確定Table 1Result of optimal antigen coating concentration and serum dilution

2.3.2特異性試驗通過對鴨E.coli、Saimonella、Pasteurellosis、DHV、RA的陽性血清進行檢測，除RA為陽性外，其它幾種病原陽性血清OD490nm值均小于0.372(表2)，表明Camp蛋白與上述幾種血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3.3重復性試驗ELISA重復性檢測結(jié)果經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計分析，表明板內(nèi)和板間重復性檢測的變異系數(shù)均小于6%(表3)，表明所建立的ELISA檢測方法具有良好的重復性。

表2 特異性試驗結(jié)果Table 2Result of specificity test

2.3.4臨床檢測及對比試驗對吉林省部分鴨場采集240份鴨血清及12份SPF鴨血清樣本進行檢測，12份SPF鴨血清樣本均為陰性結(jié)果。240份鴨血清檢測結(jié)果如表4所示，Camp表達蛋白ELISA檢測血清抗體陽性86份，陽性率35.8%，RA菌體超聲破碎抗原ELISA檢測血清抗體陽性126份，陽性率52.5%。兩種方法的符合率為77.5%。

表4 比對試驗結(jié)果Table 4Result of comparison test

3 討 論

當前控制鴨RA感染主要辦法是用滅活油佐劑苗進行免疫。郭宇飛、謝永平及胡清海等均研制了鴨RA多價滅活疫苗，對同血清型菌攻擊有較好的免疫保護效果[5-7]。但鴨RA血清型較多并且缺乏交叉保護使滅活苗的應(yīng)用有很大局限性。因此，開發(fā)RA基因工程亞單位疫苗是目前研究的重點。Crasta等研究表明RA中存在一種唾液酸糖蛋白(Camp因子)，與鏈球菌Camp因子具有相似的促進溶血素溶血功能，推測是RA的毒力因子，western blot還證明Camp蛋白能夠與血清1、2、3、5、6、13、14、19型菌株Camp表達蛋白抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)[3]。本研究克隆的camp基因與公布的RA-GD、RA-CH-1及ATCC11845等序列同源性為99%，表明其在RA菌株間具有非常高的同源性，可以用于RA的鑒定。同時，western blot分析表明該蛋白還可以與10、11、17型菌株全菌體陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，進一步表明該蛋白是眾多血清型菌所共有的，并且具有良好的免疫原性。Jiang等將Camp因子作為組分用于研制乳房鏈球菌疫苗并取得了成功[8]，因此推測RA的Camp因子也可以作為亞單位疫苗組分用于該病的防控。

本研究建立的檢測Camp的間接ELISA檢測方法，經(jīng)驗證具有良好的特異性和重復性，與全菌體裂解抗原ELISA方法的符合率達到77.5%，但抗體陽性檢出率顯著低于全菌體裂解抗原ELISA方法。推測其原因是Camp作為RA的毒力因子，只有活菌在感染過程中表達才能被檢測到，與方欽的研究結(jié)果具有一定的符合性[9]，提示該ELISA方法可以用于RA血清學流行病學調(diào)查，也為深入研究Camp提供了依據(jù)。

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[4]程龍飛，施少華.2型鴨疫里氏桿菌抗體間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2006，21(2)：131-134.

[5]郭宇飛，程安春，汪銘書，等.鴨疫里氏桿菌病四價滅活疫苗的研究[J].中國獸醫(yī)科技，2003，33(6)：3-10.

[6]謝永平，陳澤祥，許力干，等.鴨疫里氏桿菌油乳劑三價滅活疫苗的研究[J].動物醫(yī)學進展，2010，31(7)：45-48.

[7]胡清海，劉曉文，趙世華，等.鴨疫里氏桿菌病三價油乳劑滅活疫苗的研究[J].中國獸醫(yī)科技，2002，32(7)：6-9.

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