郭 鶴 孟慶慧 汪娟娟 劉 敏 (濰坊醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院，山東 濰坊 261053)

阿爾茨海默病(AD)是常見的癡呆疾病，它是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因和發(fā)病機制迄今仍不明確。所以尚缺乏有效針對性強的預(yù)防治療措施。近期研究表明，腦內(nèi)慢性炎癥可能是AD的重要致病原因之一〔1〕，抗炎治療是目前研究AD的熱點問題之一。李秀艷等〔2〕研究指出殼聚糖磷脂膽堿復(fù)合物可提高AD大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿(ACh)含量，改善腦功能。本實驗研究殼聚糖磷酯膽堿對AD大鼠的抗炎作用。采用大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ25～35制備AD炎性模型，觀察殼聚糖磷酯膽堿對AD大鼠腦海馬內(nèi)炎性因子iNOS、IKKβ表達和AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠30只，清潔級，8月齡，體重(350±30)g(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物部)。

1.2 主要藥品與試劑 殼聚糖(青島云宙生物科技有限公司，脫乙酰度97.5%);大豆卵磷脂(北京華清美恒天然產(chǎn)物技術(shù)開發(fā)有限公司，磷脂酰膽堿含量40%);Aβ25～35(美國 Sigma公司);iNOS和IKKβ抗體(美國Biowoild公司);PV法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。

1.3 藥物制備 準(zhǔn)確稱取室溫下真空干燥的磷脂及β-環(huán)糊精各適量，溶于200 ml 1%殼聚糖乙酸溶液，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，將過濾后的溶液經(jīng)蠕動泵導(dǎo)入Büchi290小型噴霧干燥器的雙流向螺旋式噴嘴(直徑0.7 mm)，根據(jù)實驗設(shè)置控制氣流量及進風(fēng)溫度，噴霧干燥“一步”制成粉末微球，得到殼聚糖磷脂酰膽堿超細(xì)粉末。分光光度法測定殼聚糖含量70.63%。

1.4 主要儀器 DMS-2 MORRIS水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所);江灣-I型C腦立體定向儀(第二軍醫(yī)大學(xué));DME型光學(xué)顯微鏡和超薄組織切片機(德國Leica公司)。

1.5 Aβ25～35的孵育 用無菌生理鹽水將 Aβ25～35稀釋成10 μg/μl。37℃孵育 7 d，使其變?yōu)槟蹜B(tài)。

1.6 實驗方法

1.6.1 動物分組及處理方法 30只Wistar大鼠隨機化分組:對照組、AD模型組和殼聚糖磷酯酰膽堿藥物組，各組10只。藥物組和模型組雙側(cè)海馬注射Aβ25～35;對照組經(jīng)同樣步驟注射0.9%生理鹽水。藥物組350 mg/kg灌胃，另兩組0.9%生理鹽水2 ml灌胃，共干預(yù)28 d。

1.6.2 AD模型制備 10%水合氯醛將模型組和藥物組大鼠麻醉后，參照大鼠腦立體定位圖譜，將頭部固定于腦立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒，切開，暴露前囟，牙科鉆打孔后，將Aβ25～35懸浮液用微量注射器注入左右側(cè)海馬區(qū)各5 μl(前囟后3.5 mm，左右旁開2.5 mm，進針深3.0 mm)，緩慢注5 min，留針10 min，使其充分彌散，緩慢退針。消毒傷口，縫合，定期手術(shù)部位消毒。

1.6.3 Morris水迷宮觀察 該實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，每次6 d，共三次(造模前，造模7 d后，藥物干預(yù)28 d后)，實驗分兩部分，5 d定位航行試驗和1 d空間探索實驗。5 d定位航行試驗中，每天上午，下午各一次，分別將每只大鼠從四個象限面朝壁放入水中，記錄尋找平臺所用時間，既大鼠逃避潛伏期(EL)。如果大鼠2 min內(nèi)未找到平臺，將其牽引平臺處停留10 s，EL計120 s。第六天空間探索實驗，撤去平臺，選第一象限入為水點將大鼠面朝壁放入，測其在2 min內(nèi)跨過原平臺位置次數(shù)和在原平臺象限停留時間。

1.6.4 HE和免疫組織化學(xué)染色 10%水合氯醛將大鼠麻醉，0.9%生理鹽水200 ml，4%多聚甲醛300～400 ml心臟灌注，然后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，冠狀面切取腦海馬注射點周圍組織，經(jīng)浸洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟后，每只大鼠隨機取相同部位連續(xù)5張切片，進行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)染色檢測。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖磷酯酰膽堿對大鼠學(xué)習(xí)記憶水平的影響 造模前，各組大鼠學(xué)習(xí)記憶水平比較沒有差異(P＞0.05)。造模7 d后，模型組和藥物組的學(xué)習(xí)記憶水平明顯低于對照組(P＜0.05)，藥物干預(yù)28 d后，模型組大鼠AEL明顯延長、空間探索實驗單位時間內(nèi)跨越原平臺次數(shù)和在原平臺象限停留時間減少，與對照組有顯著差異(P＜0.05)，和藥物組也有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，每組兩兩比較結(jié)果見表1，表2。

2.2 HE觀察結(jié)果 光鏡下HE染色結(jié)果顯示，對照組和藥物組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則整齊，細(xì)胞形態(tài)完整，但藥物組有較少的壞死神經(jīng)細(xì)胞(圖1A，B)。模型組大鼠海馬注射區(qū)周圍可見海馬神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，局部神經(jīng)元受損，小膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，胞核固縮，細(xì)胞染色變深(圖1C)。

表1 各組大鼠水迷宮逃避潛伏期成績(±s，n=10)

表1 各組大鼠水迷宮逃避潛伏期成績(±s，n=10)

與對照組比較:1)P＜0.05;與藥物組比較:2)P＜0.05

組別 造模前(s) 造模7 d后(s) 造模28 d后(s)對照組0.688 0.00 0.00 15.87±6.90 12.06±5.89 11.91±5.11模型組 15.38±8.14 25.33±13.631) 27.08±9.951)2)藥物組 15.53±7.79 25.76±16.33 17.54±8.07 F值 0.374 89.235 222.387 P值

表2 各組大鼠空間探索實驗成績(±s，n=10)

表2 各組大鼠空間探索實驗成績(±s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 跨越平臺次數(shù)造模前 造模7 d后 造模28 d后平臺象限停留時間(s)造模前 造模7 d后 造模28 d后對照組 6.05±1.54 7.25±2.79 8.05±2.161) 40.23±15.82 47.73±17.70 53.84±15.551)模型組 5.50±1.32 3.25±1.83 3.70±2.03 40.04±19.19 15.37±11.39 20.44±17.54藥物組 5.75±1.33 3.40±1.64 6.00±2.221) 37.70±16.98 16.61±8.47 37.67±18.461)F值 0.774 22.343 20.673 0.132 39.199 18.801 P值0.466 0.00 0.00 0.877 0.00 0.00

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果 圖2可見，陽性細(xì)胞呈棕黃色，模型組海馬CA1區(qū)可見iNOS和IKKβ大量表達(iNOS胞核、胞質(zhì)均有表達，IKKβ胞質(zhì)表達)。對照組陽性細(xì)胞表達很少，藥物組陽性細(xì)胞表達介于二者之間，見表3。

圖1 不同組海馬C A1區(qū)HE染色的病理改變(HE，×400)

圖2 不同組海馬CA1區(qū)iNOS及IKKβ表達(DAB，×400)

表3 各組大鼠的iNOS和IKKβ陽性細(xì)胞表達數(shù)(±s，n=10)

表3 各組大鼠的iNOS和IKKβ陽性細(xì)胞表達數(shù)(±s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

iNOS對照組 8.80±1.791) 9.02±2.381)組別 iKKβ 0.00 0.00模型組 41.40±4.17 38.20±2.38藥物組 20.40±4.222) 19.80±4.602)F值 96.827 99.074 P值

3 討論

Aβ異常沉積形成老年斑是AD典型病理特征。近年實驗研究表明，炎癥反應(yīng)貫穿AD慢性病程的始終，膠質(zhì)細(xì)胞活化是AD腦炎癥反應(yīng)的一個顯著特征，它能誘導(dǎo)一系列炎癥細(xì)胞活化，增殖〔3～5〕。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞存在很強的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)作用同時還能上調(diào)炎癥因子表達(如 TNF-α、IL-6、IL-1 等)〔6〕。本實驗采用大鼠雙側(cè)海馬立體定向注射Aβ25～35的方法建立A D動物模型，觀察殼聚糖磷脂膽堿對在體條件下Aβ25～35誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及其分泌產(chǎn)物的影響。

IκB激酶是 NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成員之一，IKKβ是 IκB激活作用的主要成分〔7〕。經(jīng)典途徑 IKKβ/NF-κB 激活 NF-κB，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的表達與細(xì)胞凋亡〔8〕。IKKβ過表達或活性增加可以有效刺激炎癥因子的生成，從而增加炎癥反應(yīng)〔9，10〕。Aβ能激活膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的 NF-κB通路，促使炎癥因子分泌iNOS〔11〕。iNOS是炎癥中的一種反應(yīng)性酶類，是膠質(zhì)細(xì)胞增生表達與神經(jīng)元損傷的標(biāo)志。Capiralla等〔12〕研究通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄和若干NF-κB 靶基因的表達，可抑制IKK/IκB/NF-κB通路，減輕AD腦炎癥反應(yīng)。因此，IKKβ和iNOS是炎癥反應(yīng)中的重要因子。用藥物抑制IκB激酶激活作用，降低NF-κB的激活，可能起到抑制炎癥因子IKKβ，iNOS的激活增生，從而抑制IKKβ/NF-κB通路，減輕AD腦炎癥反應(yīng)。本研究說明AD模型制備成功及藥物殼聚糖磷脂膽堿有抑制海馬部位炎癥反應(yīng)的作用。可能的機制是殼聚糖磷酯酰膽堿有一定的抑制或延遲IκB激酶激活，起到保護神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞作用，降低了炎癥因子激活增生，從而抑制或延遲了IKKβ/NF-κB通路的激活。

殼聚糖是甲殼素脫乙酰化產(chǎn)物，具有良好的生物相容性，能打開細(xì)胞連接，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，清除自由基，中和毒素，保護腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜的作用，在活化神經(jīng)細(xì)胞和抗衰老方面具有特殊功效，其抗炎作用可延遲并減輕AD的病理改變。機體服用磷脂后經(jīng)轉(zhuǎn)化，可增加ACh含量，直接被大腦利用。本實驗將殼聚糖和磷脂采用噴霧干燥方法制備殼聚糖磷脂微球，提高其黏附性和降低清除率，可控制藥物的釋放，增加了藥物生物利用度和親水性藥物通過上皮的滲透性。李秀艷等〔2〕研究指出殼聚糖磷脂膽堿復(fù)合物可能通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)乙酰膽堿代謝，提高AD大鼠腦內(nèi)ACh含量，改善腦功能。本實驗研究殼聚糖磷脂酰膽堿(殼聚糖∶磷脂∶環(huán)糊精=2∶1∶0.33)對AD大鼠的抗炎治療作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)殼聚糖磷脂膽堿可以減少Aβ25～35誘導(dǎo)的AD炎性大鼠模型IKKβ和iNOS的陽性表達，能從行為學(xué)上改善AD大鼠的空間學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知能力。殼聚糖磷酯酰膽堿組比模型組大鼠找到平臺時間明顯縮短，單位時間內(nèi)跨越原平臺次數(shù)和在原平臺象限停留時間較模型組明顯提高。這說明殼聚糖磷酯酰膽堿具有一定對抗AD大鼠腦海馬內(nèi)炎癥反應(yīng)、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增生及改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的作用。本實驗屬于小樣本研究，其抗炎治療作用及機制還有待進一步大樣本研究。

1 Tuppo EE，Arias HR.The role of inflammation in Alzheimer's disease〔J〕.Biochem Cell Biol，2005;37(2):289-305.

2 李秀艷，王玉蘭，郭方明.殼聚糖磷脂復(fù)合物治療癡呆模型屬的實驗研究〔J〕.老年性癡呆專題研究，2005;27(3):161-4.

3 Ransohoff RM.Cardona AE.The myeloid cells of the central nervous system parenchyma〔J〕.Nature，2010;468(7321):253-62.

4 Sastre M，Koekgether T，Heneka MT.Contribution of inflammatory proeesses to Alzheimer's disease:molecular mechanisms〔J〕.Int J Dev Neurosc，2006;24(2-3):167-76.

5 Galimberti D，Scarpini E.Inflammation and oxidative damage in Alzheimer's disease:friend or foe〔J〕?Front Biosci(Schol Ed)，2011;3(1):252-66.

6 Landreth GE.Reed-Geaghan EG.Toll-like receptors in Alzheimer's disease〔J〕.Curr Top Microbiol Immunol，2009;336(3):137-53.

7 崔 篙，劉學(xué)鋒，吳 斌.NF-κB在腫瘤中的研究進展〔J〕.現(xiàn)代腫瘤學(xué)，2009;17(1):134-7.

8 王少雄，王少元.核因子kB與惡性血液病?〔J〕.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2007;34(8):489-92.

9 Bolignano D，Donato V，Coppolino G，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)as a marker of kidney damage〔J〕.Am J Kidney Dis，2008;52(3):595-605.

10 Michael K，Yumi Y，Wang QM.The IKK NF-kB system:a treasure trove for drug development〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2004;3(1):17-26.

11 楊 怡，章恩明，鄭筱祥.淀粉樣蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元壞死和凋亡中的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和NF-kB信號通路〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2005;4(3):29521-3.

12 Capiralla H，Vingtdeux V，Zhao H，et al.Resveratrol mitigates lipopolysaccharide-and Aβ-mediated microglial inflammation by inhibiting the TLR4/NF-κB/STAT signaling cascade〔J〕.J Neurochem，2012;120(3):461-72.