邱霞 姜永梅

葡多酚(grape procyanidins，GPC)是從新鮮葡萄籽中提取的一種天然植物多酚物質(zhì)［1］。國內(nèi)外研究證實，GPC具有清除自由基、抗氧化和提高細(xì)胞增殖活性等多種生物學(xué)功效［2-3］。本實驗采用GPC加入飼料喂養(yǎng)大鼠的方法，觀察GPC對老齡大鼠抗氧化能力及肝細(xì)胞增殖活性的影響。

1 對象與方法

1.1 實驗動物與分組 自山東省魯抗醫(yī)藥實驗中心購清潔級健康雄性15月齡Wistar大鼠40只，體質(zhì)量310～485 g，隨機(jī)分為空白對照組和GPC低、中、高劑量組，每組10只。于本實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 飼料配制 葡多酚為本實驗室制備，含量＞99%，標(biāo)準(zhǔn)品由日本島田株式會社提供。大鼠飼料購自中科院實驗動物研究所。GPC低、中、高劑量組的飼料為每公斤普通飼料中分別加入10、100、200 mg的GPC。以上3組充分混勻后制成餅狀。

1.3 試劑與儀器 大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)、二甲亞砜(DMSO)購自美國GLBCD BRL公司。自動酶標(biāo)儀為瑞典產(chǎn)RosysAnthos 2010型。

1.4 實驗方法 空白對照組喂飼普通飼料，GPC低、中、高劑量組分別喂飼加入前述不同劑量GPC的普通飼料。各組動物均自由進(jìn)食，喂養(yǎng)50 d后次日清晨處死大鼠，腹主動脈取血，分離血清備檢GSH-Px、SOD和MDA。無菌條件下取出肝臟剪碎，制成單細(xì)胞懸液用以檢測細(xì)胞增殖活性。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 抗氧化指標(biāo):取血清2 ml按說明書方法采用還原法測定GSH-Px活力，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.5.2 細(xì)胞增殖活性(MTT法):取制備好的肝細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加0.1 ml細(xì)胞懸液，每個樣本設(shè)3個平行孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，加入5 mg/ml MTT 液，10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。每孔加入0.1 ml二甲亞楓(DMSO)，吹打溶解，在酶標(biāo)儀上記錄492 nm波長溶液的吸光值(A值)。計算不同劑量的GPC對肝細(xì)胞增殖的促進(jìn)率:促進(jìn)率(%)=(GPC組 -空白對照組)/空白對照組×100%

1.6 統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。

2 結(jié)果

2.1 GSH-Px、SOD和MDA檢測結(jié)果 GPC中、高劑量組的SOD、GSH-Px和MDA與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠GSH-Px、SOD和MDA檢測結(jié)果±s，n=10)

表1 各組大鼠GSH-Px、SOD和MDA檢測結(jié)果±s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與GPC低劑量組比較，△P＜0.05

組別 GSH-Px(U/ml) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)空白對照組＊△1229.84±70.55 597.88±88.60 12.38±1.33 GPC低劑量組 1275.19±70.17 605.57±101.12 11.45±1.16 GPC中劑量組 1327.17±82.53* 658.95±12.30* 8.72±0.90*GPC高劑量組 1420.11±75.34＊△ 729.70±12.04＊△ 6.40±1.25

2.2 肝細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果 GPC中、高劑量組的A值分別為1.18±0.13、1.29±0.10，均較空白對照組的增殖活性明顯升高(P＜0.05);GPC高劑量組細(xì)胞增殖促進(jìn)率高于GPC低劑量組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果±s，n=10)

表2 各組大鼠肝細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果±s，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05;與GPC低劑量組比較，△P＜0.05

組別 A值 促進(jìn)率(%)0.98±0.12 -GPC低劑量組 1.08±0.11 31.91±9.27 GPC中劑量組 1.18±0.13* 46.65±10.34 GPC高劑量組 1.29±0.10＊△ 58.49±12.02空白對照組△

3 討論

氧化應(yīng)激是反映機(jī)體抵抗氧化損傷的一個重要指標(biāo)，人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)對于消除機(jī)體高水平的氧化物，維護(hù)細(xì)胞及神經(jīng)元的正常生理功能有著重要的作用。隨著年齡增長，機(jī)體清除氧自由基的酶活性降低，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)元DNA損傷和記憶神經(jīng)質(zhì)受體的興奮性神經(jīng)毒性作用，最終引起老年癡呆癥的發(fā)生和發(fā)展［4］。流行病學(xué)資料顯示膳食中補(bǔ)充某些植物化學(xué)物可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化水平，降低衰老過程中對氧化應(yīng)激的易感性，改善運動及認(rèn)知行為功能，是預(yù)防老年癡呆癥的一個重要手段［5］。

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能催化還原型谷胱甘肽變?yōu)檠趸凸入赘孰?，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，并防止過氧化物水解產(chǎn)生MDA。SOD可催化超氧陰離子(O2-)歧化為H2O2和O2，再經(jīng)過氧化氫酶催化生成水，從而消除自由基的損害。MDA是脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)終止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量反映了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的強(qiáng)弱［6］。本實驗結(jié)果顯示，GPC高劑量組的SOD、GSH-Px活力較空白對照組顯著性升高，而MDA含量顯著性降低，表明GPC可增強(qiáng)老齡大鼠的抗氧化能力，其機(jī)制與GPC具有較強(qiáng)的自由基清除活性有關(guān)［7］。

細(xì)胞增殖活性水平是反映細(xì)胞生命力強(qiáng)弱的一個重要指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞受到生理病理因素?fù)p傷時，首先表現(xiàn)出增殖活性的降低［8］。MTT法通過檢測吸光度值的變化反映細(xì)胞生長及增殖活性。本次動物實驗結(jié)果顯示，GPC中、高劑量組均較空白對照組的增殖活性明顯升高，且GPC高劑量組細(xì)胞增殖促進(jìn)率明顯高于低劑量GPC組。表明GPC對老齡大鼠肝細(xì)胞的增殖活性有促進(jìn)作用，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相一致［3］。

綜上研究結(jié)果認(rèn)為，GPC具有增強(qiáng)老齡大鼠清除自由基能力，促進(jìn)細(xì)胞增殖活性，提高機(jī)體抗氧化力等功效，在抗衰老和老年癡呆癥的預(yù)防和治療方面有較好應(yīng)用前景。

［1］Puiggros F，Llopiz N，Ardevol A，et al.Grape seed procyanidins prevent oxidative injury by modulating the expression of antioxidant enzyme systems［J］.J Agric Food Chem，2005，53(15):6080-6086.

［2］Zhu QY，Schramm DD，Gross HB，et al.Influence of cocoa flavanols and procyanidins on free radical-induced human erythrocyte hemolysis［J］.Clin Dev Immunol，2005，12(1):27-34.

［3］鐘進(jìn)義，李杰，劉輝，等.葡多酚對肝細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度和增殖活性的影響［J］.衛(wèi)生研究，2006，35(5):567-572.

［4］王豪，瞿正萬，朱莉娜，等.阿爾茨海默病血漿總抗氧化狀態(tài)與同型半胱氨酸水平的臨床研究［J］.實用老年醫(yī)學(xué)，2011，25(1):50-55.

［5］楊亞丹，蔣與剛.老年癡呆癥營養(yǎng)干預(yù)的研究進(jìn)展［J］.實用老年醫(yī)學(xué)，2010，24(3):248-250.

［6］Bagchi D，Ray SD，Bagchi M，et al.Mechanistic pathways of antioxidant cytoprotection by a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract［J］.Indian J Exp Biol，2002，40(6):717-726.

［7］Valko M，Leibfritz D，Moncol J，et al.Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39(1):44-84.

［8］Bader N，Bosy-Westphal A，Koch A，et al.Influence of vitamin C and E supplementation on oxidative stress induced by hyperbaric oxygen in healthy men［J］.Ann Nutr Metab，2006，50(3):173-176.