張江英，董立偉，王小舟，朱國強(qiáng)

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

針對fim W基因沙門氏菌的特異性PCR檢測

張江英，董立偉，王小舟，朱國強(qiáng)*

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

為建立沙門氏菌快速檢測方法，本研究根據(jù)沙門氏菌Ⅰ型菌毛蛋白調(diào)控基因fimW設(shè)計一對引物，建立PCR檢測方法，并對收集的A群～F群14個血清型40株沙門氏菌和5種12株非沙門氏菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示所有沙門氏菌均擴(kuò)增出與預(yù)期(477 bp）相符的特異性片段，而非沙門氏菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。另外，以腸炎沙門氏菌50336株DNA為模板，敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示該方法可以檢測出擴(kuò)增體系中1pg DNA染色體和102cfu的沙門氏菌。表明本研究建立了檢測沙門氏菌簡潔、敏感、特異的PCR方法。

沙門氏菌；檢測；fimW基因；PCR

沙門氏菌(Salmonella）能夠引起人和動物多種不同臨床表現(xiàn)的沙門氏菌病，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)中非常重要[1]。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法耗時長，并且操作繁瑣，難以應(yīng)對各部門對沙門氏菌病的實(shí)時監(jiān)控。因此，建立快速、靈敏、特異的沙門氏菌檢測方法十分必要。目前沙門氏菌快速檢測方法多采用免疫學(xué)方法、核酸分子雜交以及PCR等，其中PCR方法越來越被廣泛用于沙門氏菌檢測。

菌毛是大多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌外膜上的蛋白質(zhì)附屬物[2]。沙門氏菌菌毛類型較多，主要有Ⅰ型～Ⅳ型等，但其分布不同，Ⅱ型菌毛主要分布于雞白痢、雞傷寒和都柏林沙門氏菌，Ⅲ型菌毛主要分布于腸炎和鼠傷寒沙門氏菌，Ⅳ型菌毛主要分布于鼠傷寒沙門氏菌，只有Ⅰ型菌毛廣泛分布于各類沙門氏菌。沙門氏菌Ⅰ型菌毛蛋白由fimA、fimI、fimC、fimD、fimH、fimF、fimZ、fimY和fimW9個基因編碼[3]，研究表明fimZ、fimY和fimW3個基因?yàn)橹饕珌唵挝坏鞍譮imA的調(diào)控基因[4]。對Gen-Bank中fimW序列進(jìn)行比對顯示沙門氏菌菌株的fimW同源性很高，而且在其它腸道桿菌如大腸桿菌等基因組中未發(fā)現(xiàn)與fimW同源的序列。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)fimW設(shè)計一對引物，用以沙門氏菌屬的特異性檢測。

1 材料和方法

1.1 菌 株 本實(shí)驗(yàn)所用菌株見表1。其中鼠傷寒沙門氏菌SL1344、LT2、CT18、SL 3261；丙型副傷寒沙門氏菌 RKS 4594；傷寒沙門氏菌 SARC2、SARC3、SARC4和亞利桑那沙門氏菌SARC6(共9株）為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)惠贈；其余菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000購自寶生物工程(大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的鼠傷寒沙門氏菌fimW基因核苷酸序列，通過DNAStar軟件進(jìn)行序列同源性分析，在fimW基因可變區(qū)兩端設(shè)計一對引物，由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。fimW Up：5'-AACAGTCACTTTGAGC ATGGGTT-3'；fimW Lo：5'-GAGTGACTTTGTCTGC TCTTCA-3'。預(yù)期擴(kuò)增片段為477 bp。

1.4 PCR模板的制備 采用煮沸裂解法制備模板[5]。核酸蛋白定量儀測定模板濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增體系與程序 PCR擴(kuò)增體系(25 μL）：10×PCR Buffer(20 mmol/L MgCl2）2.5 μL，模板2.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，dNTPs 1.0 μL，rTaq酶2.5 U，雙蒸水補(bǔ)足。

PCR擴(kuò)增程序：94℃4 min；94℃1 min、50℃1 min、72℃ 1 min，25個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 PCR敏感性試驗(yàn) 以腸炎沙門氏菌50336為參照，煮沸裂解法制備模板，測定DNA含量，并依次做10倍倍比稀釋至0～100 ng，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析；將過夜培養(yǎng)的腸炎沙門氏菌50336以生理鹽水倍比稀釋，每個梯度取2.5 μL直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時取2.5 μL涂布LB平板，37℃培養(yǎng)16 h計數(shù)，以此判定PCR檢測純菌的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 以提取的腸炎沙門氏菌50336 DNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物約 500 bp(圖1），與預(yù)期結(jié)果(477 bp）相符。

圖1 fimW基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 Specific amplification ofSalmonella fimWgene fragment by PCR

2.2 PCR特異性試驗(yàn)檢測結(jié)果 將本實(shí)驗(yàn)中所有細(xì)菌參照煮沸裂解法制備模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，40株沙門氏菌均出現(xiàn)目的片段，而12株非沙門氏菌均未出現(xiàn)目的片段(表1）。

2.3 PCR敏感性試驗(yàn)檢測結(jié)果 以腸炎沙門氏菌50336株DNA為模板進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示僅1 pg的DNA仍能夠擴(kuò)增出清晰的目的片段(圖2）。以腸炎沙門氏菌50336菌體直接PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：當(dāng)體系中含有102cfu的細(xì)菌時仍可以擴(kuò)增出清晰目的片段(圖2）。表明該P(yáng)CR方法具有良好的敏感性。

3 討 論

PCR技術(shù)具有速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。采用PCR技術(shù)檢測沙門氏菌，其特異性主要取決于所擴(kuò)增靶序列是否為沙門氏菌高度保守的特異性片段以及引物的設(shè)計[6]。

表1 菌株分類及PCR檢測結(jié)果Table 1 All strains used in this study and the PCR detection

圖2 PCR擴(kuò)增沙門氏菌的敏感性檢測Table 2 The sensitive test of PCR forSalmonella fimWgene

本實(shí)驗(yàn)建立的PCR方法具有快速簡便，靈敏性、特異性高的特點(diǎn)，為沙門氏菌的臨床檢測提供了技術(shù)保證。本實(shí)驗(yàn)對所選的40株沙門氏菌和12株非沙門氏菌進(jìn)行fimW基因的PCR擴(kuò)增，能夠從中篩選出所有的沙門氏菌，特異性高達(dá)100%。而且敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該P(yáng)CR能夠擴(kuò)增出體系中1 pg和102cfu的腸炎沙門氏菌50336株，敏感性高。為進(jìn)一步檢測該P(yáng)CR方法的特異性，我們將收集更多的沙門氏菌(包括標(biāo)準(zhǔn)株和各地分離的野生株）和非沙門氏菌進(jìn)行檢測。

[1]鄢志剛，徐鋒，王建.食源性沙門氏菌快速檢測技術(shù)的應(yīng)用研究[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，1：19-20.

[2]陳小玲，李永清.沙門氏菌fimY基因的原核表達(dá)及禽沙門氏菌抗體檢測ELISA研究[J].中國家禽，2012，34(13）：19-20.

[3]Zeiner S A,Dwyer B E,Clegg S.FimA,FimF,and FimH are necessary for assembly of type 1 fimbriae onSalmonella entericaserovarTyphimurium[J].Infect Immun,2012,80(9）:3289-3296.

[4]Saini S,Pearl J A,Rao C V.Role of FimW,FimY,and FimZ in regulating the expression of type I fimbriae inSalmonella entericaserovarTyphimurium[J].Bacteriol,2009,191(9）:3003-3010.

[5]Maclnnes J I,Borr J D,Massoudi M,et al.Analysis of southern OntariaActinobacillus(Haemophilus）pleuropneumoniae isolates by restriction endonuclease fingerprinting[J].Canadian J Vet Res,1990,54(2）:244-250.

[6]伍義行，王建國，王芳.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在沙門氏菌檢測中的研究進(jìn)展[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué)，1989，1：13-15.

Simple and rapid detection ofSalmonellaby direct PCR amplification of thefimWgene

ZHANG Jiang-ying,DONG Li-wei,WANG Xiao-zhou,ZHU Guo-qiang*
(College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China）

In the present study,a specific PCR method for detectingSalmonellaspecies was established with a pair of primers designed to according to thefimWgene,which encoded a protein involved in regulatingSalmonellatypeⅠfimbriae expression.The detection results showed that the 477 bp specific DNA fragments were amplified from all of 40Salmonellastrains of 14 serovars with a detection limit of 1pg genomic DNA or 102cfu in the amplifying system with the template DNA fromS.enteritis50336 strain,but no any amplification from 12 non-Salmonellabacteria strains of 5 species.Therefore,the established method is a simple,sensitive and specific forSalmonelladetection.

Salmonella;detection;fimWgene;PCR

S852.61

A

1008-0589(2013）10-0837-03

10.3969/j.issn.1008-0589.2013.10.15

*Correspondingauthor

2012-06-27

國家自然科學(xué)基金(31101833、31101826、31270171）；揚(yáng)州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計劃項目(yz2011066）

張江英(1986-），女，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事病原微生物學(xué)研究.

*通信作者：E-mail：yzgqzhu@hotmail.com

(本文編輯：張朝霞）