梅 枚 楊 琳 樊子川 程國強(qiáng) 王來栓 曹 云 陸 煒 周文浩

Prader-Willi 綜合征( PWS) 是一種累及多系統(tǒng)的非孟德爾遺傳性疾病，是印記遺傳的典型代表，人群發(fā)病率為1/10 000 ～1/30 000［1～3］。PWS 在新生兒期以嚴(yán)重肌張力低下和吮吸障礙為特點(diǎn)，隨后可出現(xiàn)過度飲食、肥胖，并常伴有特殊面容、動(dòng)作語言發(fā)育遲緩、性腺發(fā)育不良、認(rèn)知障礙和行為異常等。PWS 發(fā)病機(jī)制包括：①父源15q11-13 區(qū)域缺失占65% ～75%；②15q11-13 母源單親二倍體( UPD)占20% ～30%；③印跡基因功能缺陷占1% ～3%［4］。在父源性缺失病例中，遠(yuǎn)端斷裂點(diǎn)常固定，而依據(jù)近端斷裂點(diǎn)不同，可分為Ⅰ型缺失( del Ⅰ) 、Ⅱ型缺失( del Ⅱ) ，缺失大小分別約為6. 58 和5. 33 Mb［5］。1993 年，Holm 等［6］在Pediatrics 上發(fā)表了PWS 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，但其確診依賴于遺傳學(xué)檢測，尤其是對于臨床表現(xiàn)不典型的新生兒。在基因型和表型關(guān)聯(lián)性研究方面，已有的研究數(shù)據(jù)顯示： UPD 型，父源性Ⅰ型缺失、Ⅱ型缺失患者可有表型異常［7～12］，但以往研究涉及新生兒的較少。詹實(shí)娜等［13］對9 例父源性缺失型、4 例UPD 型PWS 新生兒研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，UPD 型患兒的特殊面容和男性生殖器發(fā)育不全的發(fā)生率低于父源性缺失型患兒，但對Ⅰ、Ⅱ 型缺失未做比較。本文納入經(jīng)Affymetrix SNP 芯片篩查全基因組拷貝數(shù)變異( CNVs) 或甲基化多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)( MS-MPLA) 確診的PWS 父源性缺失患兒，分析Ⅰ、Ⅱ型缺失臨床表型的差異，豐富PWS表型基因型的數(shù)據(jù)。

1 方法

1.1 對象 納入2011 年9 月至2012 年12 月復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院新生兒科符合PWS 臨床診斷［6］的患兒，經(jīng)Affymetrix SNP 芯片篩查全基因組拷貝數(shù)變異或MS-MLPA確診和分型為父源性Ⅰ、Ⅱ型缺失患兒。

1.2 MLPA MLPA 檢測試劑盒SALSA ME028 購自MRCHolland 公司，覆蓋15q11-13 區(qū)域，并包含可檢測不同甲基化水平的探針。操作依照產(chǎn)品說明書，DNA 預(yù)變性后與MLPA 探針雜交，左右探針經(jīng)過鏈接反應(yīng)后加入通用引物擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI 3500xl DNA 分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。之后使用GeneMarker 軟件對電泳產(chǎn)物片段長度和峰值進(jìn)行分析，并通過與對照DNA 的比較得到拷貝數(shù)水平。

1.3 SNP 芯片檢測 使用NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)檢測DNA 濃度及吸光度值，電泳檢測DNA 降解程度。取基因組DNA 3 ～5 μg 進(jìn)行芯片檢測。采用Affymetrix 公司Cytogenetic Whole-Genome 2.7 M 芯片進(jìn)行檢測。結(jié)果采用Chromosome Analysis Suite ( ChAS) 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。除外假陽性結(jié)果、在 DGV ( Database of Genomic Variation) 中報(bào)道的為正常人群的CNVs 和片段區(qū)域內(nèi)不包含基因的CNVs。

1.4 臨床資料截取 ①一般情況： 性別、胎齡、出生體重、入院年齡、體重、身長、Apgar 評分、母親年齡、健康狀況、產(chǎn)前檢查、羊水情況、分娩方式和異常家族史。②臨床表型：中樞性肌張力和吸吮力，喂養(yǎng)困難程度，特殊面容，生殖系統(tǒng)發(fā)育情況，哭聲，色素減低情況和嘴角結(jié)痂等；X 線胸片，超聲心動(dòng)圖，頭顱MRI/CT，血、尿串聯(lián)質(zhì)譜和甲狀腺功能等實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)表現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以x±s表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，對Ⅰ、Ⅱ型缺失患兒的臨床表型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 13 例父源性缺失PWS 新生兒進(jìn)入分析，其中MS-MLPA 診斷10 例( 圖1) ，3 例采用Affymetrix SNP芯片篩查診斷。如表1 所示，Ⅰ型缺失5 例，男2 例，女3例。平均入院年齡10.8 d； 平均胎齡36.2( 34 ～39) 周； 出生體重( 2 203 ±548) g，入院BMI 10.2 ±1.5。母孕年齡(27.6 ±5.9) 歲。1 min Apgar 評分( 7.8 ±1.7) 分，3 例早產(chǎn)，2 例剖宮產(chǎn)；例1 有產(chǎn)前胎動(dòng)減少和羊水污染表現(xiàn)；5 例均無異常家族史。Ⅱ型缺失8 例，男7 例，女1 例。平均入院年齡12.1 d； 平均胎齡38.9( 37 ～41) 周； 出生體重(2 943 ±578) g，入院BMI 11.5 ±1.0。母孕年齡( 28.5 ±3.4) 歲。1 min Apgar 評分(8.8 ±1.2) 分；8 例均為足月剖宮產(chǎn)，4 例羊水污染，例8 母親孕期存在無胎心妊娠史。

圖1 Ⅰ型缺失和Ⅱ型缺失MS-MLPA 結(jié)果Fig 1 MS-MLPA's result of del Ⅰand del Ⅱ

2.2 兩種缺失型臨床表型 表1 顯示，Ⅰ型和Ⅱ型缺失各表型的發(fā)生率：肌張力低下和吸吮力差均為100%，特殊面容分別為80%(4 例) 和50%(4 例) ，色素減退分別為40%(2 例) 和37.5%(3 例) ，生殖系統(tǒng)異常分別為40%(2 例)和87.5%(7 例) 。5 例伴有骨關(guān)節(jié)發(fā)育異常( Ⅰ型2 例、Ⅱ型3 例) 。Ⅰ和Ⅱ型缺失各有1 例發(fā)生呼吸暫停( 例5 和例6) 。Ⅱ型缺失中例12 伴腭裂。13 例均未發(fā)現(xiàn)有唾液黏稠導(dǎo)致嘴角結(jié)痂現(xiàn)象。

其他臨床表型：12/13 例X 線胸片均未見明顯異常。10/13 例行超聲心動(dòng)圖檢查，例1( Ⅰ型缺失) 提示為房間隔缺損，例9( Ⅱ型缺失) 提示為房間隔缺損、室間隔缺損。Ⅰ型缺失4/5 例行頭顱CT 或MRI 檢查，顯示例1 和3 有顱內(nèi)出血，例5 為左側(cè)側(cè)腦室增寬；Ⅱ型缺失7/8 例行頭顱CT/MRI 檢查，例9 提示雙側(cè)側(cè)腦室飽滿，胼胝體略薄，例13 部分腦外間隙增寬，例7 髓鞘化延遲，余4 例未發(fā)現(xiàn)異常。例1( Ⅰ型缺失) 行腹部B 超檢查發(fā)現(xiàn)雙腎多發(fā)囊性占位； 例2( Ⅰ型缺失) 尿串聯(lián)質(zhì)譜提示二羧酸尿可能； 例4( Ⅰ型缺失) 眼底檢查示雙眼色素淡，眼底呈“晚露”狀改變，可見脈絡(luò)膜血管；例9( Ⅱ型缺失) 喉鏡檢查示先天性喉軟骨發(fā)育不良。

3 討論

PWS 父源性缺失病例中，遠(yuǎn)端斷裂點(diǎn)常固定( BP3) ，I 型缺失的近端斷裂點(diǎn)在BP1，Ⅱ型缺失的近端斷裂點(diǎn)在BP2。BP1-BP2 區(qū)段大小約500 kb，包含4 個(gè)保守基因NIPA1、NIPA2、CYFIP1 和GCP5，其中NIPA1 和腦發(fā)育密切相關(guān)［14］。以往關(guān)于基因型和表型關(guān)聯(lián)性分析主要集中在父源性缺失型和UPD 型，涉及兩種缺失型的較少。2004 年，Butler 等［8］對12 例Ⅰ型缺失和14 例Ⅱ型缺失青年患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，兩種缺失型患者的體格測量指標(biāo)無明顯差異，但Ⅰ型缺失患者的行為和智力問題較Ⅱ型缺失嚴(yán)重，可能和4 個(gè)保守基因有關(guān)。Milner等［15］也發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型和Ⅱ型缺失患者臨床表型無明顯差異，但Ⅰ型缺失患者總體能力水平更低。Varela 等［16］發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型缺失患者語言發(fā)育較Ⅱ型缺失更落后。上述研究對象為大年齡兒童和成人，目前國際上尚無Ⅰ、Ⅱ型缺失PWS 新生兒表型差異的數(shù)據(jù)。對于新生兒行為、語言及心理問題尚無有效判定方式，其他表型上是否具有差異尚無數(shù)據(jù)支持。

表1 數(shù)據(jù)顯示，Ⅰ型缺失患兒的平均胎齡及出生體重較Ⅱ型缺失小。早產(chǎn)在Ⅰ型缺失組中的發(fā)生率為60%，在Ⅱ型缺失中的發(fā)生率為0，提示Ⅰ型缺失患兒可能更易發(fā)生早產(chǎn)。而胎動(dòng)減少、羊水污染和胎位異常在分型判斷上缺乏一定的指向性。

本文13 例缺失型PWS 新生兒主要臨床表現(xiàn)方面，肌張力低下和吸吮力差發(fā)生率達(dá)100%，其后依次為哭聲減弱( 84.6%) 、生殖器異常(69.2%) 、特殊面容( 61.5%) 、骨關(guān)節(jié)異常( 38. 4%) 、色素減退( 38. 4%) 、呼吸暫停(15.4%) 和腭裂(7.7%) 。肌張力低下和吮吸力差是兩型的共同表現(xiàn)，發(fā)生率為100%，與Gunay-Aygun 等［17］研究結(jié)果類似。Ⅰ型缺失較Ⅱ型缺失可能更易表現(xiàn)為特殊面容( 80% vs 50%) ，Ⅱ型缺失較Ⅰ型缺失生殖系統(tǒng)異常發(fā)生率高( 40% vs 87.5%) ，色素減退發(fā)生在Ⅰ、Ⅱ型缺失間相近；提示特殊面容和生殖系統(tǒng)異?？赡軐τ趨^(qū)分Ⅰ型和Ⅱ型缺失有一定的提示作用。本文病例同時(shí)發(fā)現(xiàn)，4 例影像學(xué)檢查提示可能存在發(fā)育異常( 左側(cè)側(cè)腦室增寬，雙側(cè)側(cè)腦室飽滿、胼胝體略薄，部分腦外間隙增寬，髓鞘化延遲) ，其中Ⅰ型和Ⅱ型缺失分別為1 和3 例，這些影像學(xué)異常是否具有臨床意義尚需要隨訪研究支持。此外，PWS 新生兒的表型還涉及循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和代謝異常，如表現(xiàn)為房間隔缺損和( 或) 室間隔缺損、雙腎多發(fā)囊性占位、二羧酸尿、喉軟骨發(fā)育不良等，其中Ⅰ型缺失可能比Ⅱ型缺失有更多樣的表型。

綜上，肌張力低下和吸吮力差是PWS 新生兒共同的臨床特征，Ⅰ型缺失可能更易發(fā)生早產(chǎn)，特殊面容，Ⅱ型生殖系統(tǒng)異常發(fā)生率較高，Ⅰ型缺失可能具有多樣的臨床表型，對其中涉及的基因機(jī)制仍有必要進(jìn)行深入研究。

[1]Holm VA, Cassidy SB, Butler MG, et al. Prader-Willi syndrome： consensus diagnostic criteria. Pediatrics,1993,91(2)：398-402

[2]Whittington JE, Holland AJ, Webb T, et al. Population prevalence and estimated birth incidence and mortality rate for people with Prader-Willi syndrome in one UK Health Region. J Med Genet,2001,38(11)：792-798

[3]Vogels A, Van Den Ende J, Keymolen K, et al. Minimum prevalence, birth incidence and cause of death for Prader-Willi syndrome in Flanders. Eur J Hum Genet,2004,12(3)：238-240

[4]Cassidy SB, Schwartz S, Miller JL, et al. Prader-Willi syndrome. Genet Med,2012,14(1)：10-26

[5]Butler MG, Fischer W, Kibiryeva N, et al. Array comparative genomic hybridization (aCGH) analysis in Prader-Willi syndrome. Am J Med Genet A,2008,146(7)：854-860

[6]Holm VA, Cassidy SB, Butler MG, et al. Prader-Willi syndrome： consensus diagnostic criteria. Pediatrics,1993,91(2)：398-402

[7]Butler MG, Sturich J, Myers SE, et al. Is gestation in Prader-Willi syndrome affected by the genetic subtype? J Assist Reprod Genet,2009,26(8)：461-466

[8]Butler MG, Bittel DC, Kibiryeva N, et al. Behavioral differences among subjects with Prader-Willi syndrome and type I or type II deletion and maternal disomy. Pediatrics,2004,113(3 Pt 1)：565-573

[9]Gillessen-Kaesbach G, Robinson W, Lohmann D, et al.Genotype-phenotype correlation in a series of 167 deletion and non-deletion patients with Prader-Willi syndrome. Hum Genet,1995,96(6)：638-643

[10]Cassidy SB, Forsythe M, Heeger S, et al. Comparison of phenotype between patients with Prader-Willi syndrome due to deletion 15q and uniparental disomy 15. Am J Med Genet,1997,68(4)：433-440

[11]Butler MG. Hypopigmentation： a common feature of Prader-Labhart-Willi syndrome. Am J Hum Genet,1989,45(1)：140-146

[12]Honea RA, Holsen LM, Lepping RJ, et al. The neuroanatomy of genetic subtype differences in Prader-Willi syndrome. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2012,159B(2)：243-253

[13]Zhan SN(詹實(shí)娜),He XY,Wang CZ, et al. Clinical phenotype study of Prader-Willi syndrome in 13 neonates. Chin J Evid Based Pediatr(中國循證兒科雜志),2012,7(3)：200-204

[14]Chai JH, Locke DP, Greally JM, et al. Identification of four highly conserved genes between breakpoint hotspots BP1 and BP2 of the Prader-Willi/Angelman syndromes deletion region that have undergone evolutionary transposition mediated by flanking duplicons. Am J Hum Genet,2003,73(4)：898-925

[15]Milner KM, Craig EE, Thompson RJ, et al. Prader-Willi syndrome： intellectual abilities and behavioural features by genetic subtype. J Child Psychol Psychiatry,2005,46(10)：1089-1096

[16]Varela MC, Kok F, Setian N, et al. Impact of molecular mechanisms, including deletion size, on Prader-Willi syndrome phenotype： study of 75 patients. Clin Genet,2005,67(1)：47-52

[17]Gunay-Aygun M, Schwartz S, Heeger S, et al. The changing purpose of Prader-Willi syndrome clinical diagnostic criteria and proposed revised criteria. Pediatrics,2001,108(5)：E92