閆 睿 初桂蘭

新生兒缺氧缺血性腦病( HIE) 是圍生期常見的嚴(yán)重疾病，也是目前新生兒重要的死亡原因之一。由于HIE 多由宮內(nèi)缺氧和( 或) 產(chǎn)程缺氧所致，其發(fā)生發(fā)展較為隱匿。HIE 的診斷手段有產(chǎn)科Apgar 評分、新生兒神經(jīng)反射和顱腦影像學(xué)檢查等，前兩者存在主觀性，而影像學(xué)診斷由于新生兒配合困難，需鎮(zhèn)靜處理，尚不能廣泛開展。因此，在上述診斷手段的基礎(chǔ)上尋求更易于檢測的血清標(biāo)志物有較好的臨床價值。血清神經(jīng)特異性烯醇化酶( NSE) 與神經(jīng)細(xì)胞分化及成熟有關(guān)［1］；視椎蛋白樣蛋白1( VILIP-1) 在腦的表達(dá)豐度最高，與神經(jīng)功能異常密切相關(guān)［2］，兩者均與腦損傷程度呈正相關(guān)。但兩者對HIE 的診斷價值尚未見報道，為此本文建立新生大鼠HIE 模型，檢測建模后不同時點血清NSE 和VILIP-1 水平，探討其診斷價值，以期為幫助HIE的診斷提供理論上的依據(jù)。

1 方法

1.1 實驗動物 新生7 d Wistar 大鼠，生長條件相同，體重(11.2 ±2.4) g，雌雄不限，共144 只，由天津市放射研究所實驗動物中心提供。

1.2 建模和分組 參照Rice 等［3］報道的方法建立新生大鼠HIE 模型，簡述如下：結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，術(shù)后放回母鼠身邊恢復(fù)2 h，后置于2.5 L 密閉玻璃容器中，以0.5 L·min-1輸入濕化的8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w1 h，取出新生大鼠返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。分為3 組： 假手術(shù)組僅分離但不結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，對照組建模后不予干預(yù)，治療組建模后予維生素E 100 μg·g-1灌胃，每日1 次。每組大鼠各48 只。

1.3 觀察指標(biāo) ①模型制備指標(biāo)：病變側(cè)腦組織大體異常改變；每組取24 只大鼠于建模后72 h 內(nèi)觀察行為學(xué)異常，如向左側(cè)傾倒或自發(fā)性左旋、肢體抽搐和尖叫等；②各組于建模后1、6、12、24、48 和72 h 檢測血清NSE 和VILIP-1 水平，每個時點處死4 只大鼠，EP 管接取斷頭處血液2 ～5滴，室溫靜置40 min 以上，常溫離心13 000 rpm × 12 min(2 次) ，吸取上清，采用ELISA 法檢測。NSE 和VILIP-1 試劑盒購自Sigma 公司。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 計量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分比表示，率的顯著性采用χ2檢驗。對NSE 和VILIP-1 水平繪制受試者工作特征( ROC) 曲線，計算曲線下面積( AUC) 。采用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIE 模型評價 對照組建模后腦組織大體可見缺血組織呈蒼白色，正常組織呈紅色。對照組和治療組缺氧5 min 后相繼出現(xiàn)間歇性抖動、躁動不安、翻滾、抽搐和活動減少等，缺氧結(jié)束后2 ～3 h 可自行恢復(fù)。

2.2 行為學(xué)評價 至本研究觀察時點建模后72 h，假手術(shù)組新生大鼠未觀察到向左側(cè)傾倒或自發(fā)性左旋、肢體抽搐和尖叫等行為學(xué)異常。對照組觀察到上述3 種行為異常分別有7、11 和8 只新生大鼠； 治療組分別有8、10 和7 只新生大鼠；對照組、治療組行為異常發(fā)生率顯著高于假手術(shù)組( P 均＜0.05) ，行為異常發(fā)生率對照組和治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組NSE 和VILIP-1 水平比較 圖1 顯示，與假手術(shù)組比較，對照組12、24 和48 h 時點的NSE 水平顯著增高( P ＜0.05) ；與對照組比較，治療組24、48 和72 h 時點的NSE 水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0.05) 。

與假手術(shù)組比較，對照組12、24、48 和72 h 時點的VILIP-1 水平顯著增高( P ＜0.05) ； 與對照組比較，治療組6、12 和24 h 時點的VILIP-1 水平顯著降低( P ＜0.05) 。

圖1 各組不同時點NSE 和VILIP-1 水平比較Fig 1 Comparison of serum NSE and VILIP-1 levels at different time points of different groups

2.4 ROC 曲線分析 以對照組作為HIE 診斷金標(biāo)準(zhǔn)，以24 h 時點對照組和假手術(shù)組血清NSE 和VILIP-1 水平繪制ROC 曲線( 圖2) ，NSE ROC AUC 為0.649(95%CI：0.511 ～0.898) ，以1 630 mg·L-1為閾值，診斷HIE 的敏感度為72.4%，特異度為63.7%； VILIP-1 ROC AUC 為0.840(95%CI：0.622 ～0.931) ，以590 mg·L-1為閾值，其診斷HIE 的敏感度為75.9%，特異度為99.9%。

為了進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn)確性，將NSE 和VILIP-1 結(jié)合繪制ROC 曲線( 圖3) ，AUC 為0.862( 95% CI： 0.641 ～0.944) ，取假陽性率為10%，預(yù)測概率值為0.901 3。

圖2 NSE 和VILIP-1 診斷HIE 的ROCFig 2 The ROC curve of NSE and VILIP-1 to diagnose HIE

圖3 NSE 和VILIP-1 聯(lián)合診斷HIE 的ROCFig 3 The ROC curve of NSE combined with VILIP-1 to diagnose HIE

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，新生7 d 大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)不成熟，其發(fā)育程度類似于孕32 ～34 周的人類胎兒或新生兒。缺氧缺血性腦損傷通常局限于頸總動脈結(jié)扎一側(cè)的大腦半球，包括選擇性神經(jīng)元死亡和凋亡，大腦皮質(zhì)，皮質(zhì)下及腦室周圍白質(zhì)，海馬，紋狀體及丘腦組織損傷［1，4］。本文對新生大鼠結(jié)扎左側(cè)頸總動脈后缺氧，可觀察到向左側(cè)傾倒或自發(fā)性左旋、肢體抽搐和尖叫等行為學(xué)異?，F(xiàn)象，提示存在神經(jīng)細(xì)胞受損。［5］。

本文選擇的血清標(biāo)志物NSE 和VILIP-1 均與腦損傷有關(guān)，其中NSE 與神經(jīng)細(xì)胞分化及成熟有關(guān)，可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺氧損害［6］。當(dāng)神經(jīng)元水腫、變性和壞死時可釋放，使腦脊液和血清NSE 升高，且腦脊液和血清NSE 水平呈正相關(guān)。近年有研究表明，NSE 在腦損傷的診斷和預(yù)后方面具有重要意義，可用來判斷腦卒中、腦外傷［7］、缺氧性腦病、腦炎、腫瘤腦轉(zhuǎn)移和癲持續(xù)狀態(tài)等神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度及預(yù)后［8］，且NSE 升高程度與腦損傷程度呈正相關(guān)［9］。VILIP-1 參與神經(jīng)元的鈣依賴型信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)信號瀑布［10，11］，有研究顯示缺血性腦卒中發(fā)生24 h，有44%的患者外周血可檢測到VILIP-1，而對照組僅為8%。

本研究發(fā)現(xiàn)，對照組12 ～48 h 時點NSE 和VILIP-1 表達(dá)水平均顯著高于假手術(shù)組，VILIP-1 變化趨勢與NSE 接近，均在24 h 升高幅度最大，且VILIP-1 的持續(xù)升高可持續(xù)至72 h。但1 和6 h 時點與假手術(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與以下原因有關(guān)：①NSE 是壞死細(xì)胞釋放的產(chǎn)物，早期病情較輕，壞死細(xì)胞數(shù)量較少，因此NSE 水平僅輕度升高；②NSE 從腦細(xì)胞釋放首先進(jìn)入腦脊液，穿過血腦屏障引起血清NSE 濃度升高存在延遲； ③VILIP-1 的表達(dá)與腦損傷存在延遲效應(yīng)。ROC 曲線分析顯示，NSE AUC 為0.649，VILIP-1 AUC 為0.840，提示VILIP 診斷價值更好，兩者結(jié)合AUC 為0.862，優(yōu)于單一指標(biāo)。另有文獻(xiàn)報道，即使輕度(2%) 溶血亦可能導(dǎo)致NSE 水平升高5 倍［12］。因此，當(dāng)有溶血發(fā)生時可能導(dǎo)致NSE 檢測結(jié)果呈假陽性。

新生兒HIE 造成的神經(jīng)損害多為不可逆，目前較為有效的治療手段為在對癥支持基礎(chǔ)上加亞低溫治療［13～15］。維生素E 為抗氧化劑，減少超氧化物對細(xì)胞的損傷［16］。臨床上用于治療腦卒中［17］，雖然新生兒HIE 與成年人腦卒中發(fā)病機(jī)制不盡相同，前者是由于血液攜氧量降低，后者是由于血流中斷，但共同點是均出現(xiàn)腦細(xì)胞缺氧。HIE 造成腦細(xì)胞壞死和凋亡已成為共識［10］，因此推斷細(xì)胞內(nèi)亦存在氧自由基增多，故本研究治療組選擇維生素E 進(jìn)行干預(yù)，主要觀察其對NSE 和VILIP-1 水平的影響，結(jié)果顯示，治療組NSE 水平較對照組下降，從12 h 時點起差異有統(tǒng)計學(xué)意義；VILIP-1 水平6、12 和24 h 治療組顯著低于對照組，提示維生素E 干預(yù)24 h 后的效果可能較差。但治療組和對照組在觀察時間內(nèi)行為學(xué)異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示神經(jīng)功能未能恢復(fù)，推測原因如下：①NSE 具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能，維生素E 降低血清NSE 水平，不利于神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)；②維生素E 療程和劑量不足。

本文研究結(jié)果顯示，NSE 和VILIP-1 對新生大鼠HIE具有中等的診斷價值，但兩者均為神經(jīng)損傷指標(biāo)，在新生兒顱內(nèi)感染、癲或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病亦可升高［18］，其中NSE 已證實在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒體內(nèi)顯著增加［19］，因此仍需結(jié)合其他診斷手段進(jìn)行診斷。維生素E 對新生兒HIE的療效不顯著。

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