曹守強 趙桂彬 董慶 韓敬泉 辛衍忠 閆宇博 李吉堯 崔鍵

肺癌是導致人類死亡的第一高發(fā)癌癥。肺腺癌是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的一種，雖然可以通過手術切除和放化療進行治療，但患者預后通常較差。近幾年隨著小分子靶向藥物治療的興起，使部分肺腺癌患者的生存期明顯延長，生活質量得到改善。然而臨床研究[1]表明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變陽性的肺腺癌患者對EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）的有效率可達70%-80%，而野生型的患者有效率僅約10%-20%，治療存在局限性。即便EGFR-TKI初始治療有效的患者，隨著治療時間的延長，最終幾乎都會出現(xiàn)獲得性耐藥，而且，嚴重的皮膚副反應等并發(fā)癥常使很多患者被迫停藥。以上種種問題限制了EGFR-TKI的推廣使用，在不久的將來，EGFR-TKI必將被副作用小、適用人群廣的靶向藥物所取代。

STAT5是STAT家族中的成員，受細胞因子或生長因子激活后發(fā)生磷酸化改變，由細胞漿穿梭入細胞核，參與轉錄調(diào)控，并在細胞的生長及分化過程中起到關鍵作用。在人體內(nèi)很多組織存在STAT5的表達，而且血液、乳腺、頭頸部及前列腺腫瘤等存在STAT5的激活，其參與了腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡等生物學行為。COX-2是COX家族中的一員，COX-2在多種實體瘤如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌中均存在較高表達，并參與了腫瘤細胞的調(diào)亡、腫瘤侵襲、血管發(fā)生及腫瘤轉移等過程。越來越多的研究表明COX-2在肺癌發(fā)生過程中起關鍵作用，COX-2的過度表達可以抑制細胞調(diào)亡，刺激血管生成，促進腫瘤細胞的浸潤與轉移，導致肺癌疾病進展[2]，并可作為判斷肺癌預后的指標[3]。而COX-2抑制劑無論與其它藥物聯(lián)合治療或單獨使用，均因其對肺癌血管生成的抑制而具有治療作用[2]。因此，COX-2成為肺癌未來診斷與治療研究的新熱點。但在肺腺癌中COX-2是否受到細胞因子的刺激后表達發(fā)生改變，以及STAT5是否參與了COX-2表達的調(diào)控等機制至今仍不明確。帶著這些疑問，我們對肺腺癌A549細胞中STAT5對COX2的調(diào)控機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株A549購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。STAT5和p-STAT5a/b兔抗人抗體購自美國Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔二抗購自美國Sigma公司。STAT5短片斷干擾RNA（small interfer RNA, siRNA）（ON-TARGETplus SMARTpool siRNA），ON-TARGETplus Non-targeting siRNA（陰性對照）及DharmaFECT siRNA轉染試劑均購自美國Dharmacon公司。STAT5顯性負突變體（AdCMV5 Stat5a△740）及野生型STAT5（AdWTSTAT5）質粒由名古屋市立大學醫(yī)學科學院Hiroko Yamashita教授惠贈。ProteoJETTM細胞漿和細胞核蛋白提取試劑盒購自加拿大Fermentas公司。蛋白提取試劑盒購自美國Milipore公司。Bradford蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。含有STAT5結合位點的生物素標記雙鏈探針（5'-biotin-AGATTTCTAGGAATTCGCAG-3'）購自美國Affymetrix公司。DuoSet IC（Intracellular）Active Transcription Factor Assays（用于檢測轉錄因子結合實驗）購自英國R&D公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記的羊抗兔抗體購自美國Chemicon公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。PCR所用引物均由大連TaKaRa公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞株A549用含有10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（美國Gibco公司）在37oC、5%CO2、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨后將細胞接種于12孔板中進行EGF（Invitrogen公司，100 ng/mL）激活實驗及轉染研究。

1.2.2 免疫熒光法檢測STAT5核穿梭現(xiàn)象 A549細胞爬片24 h，待細胞伸展并牢固貼附玻片后用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）洗滌細胞，更換為含0.1%血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜。次日更換為含100 ng/mL EGF和10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，1 h后，用PBS沖洗，4%多聚甲醛固定10 min，0.25% Triton X-100透化處理細胞，5%胎牛血清封閉1 h，用兔抗人STAT5或p-STAT5a/b一抗（1:100稀釋）4oC孵育過夜。PBS洗滌后，用FITC標記的羊抗兔二抗（1:200稀釋）孵育2 h。Hoechst33258細胞核染色后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 STAT5 siRNA的轉染及分組研究 待A549細胞鋪滿板底約80%-90%時，根據(jù)商品說明書使用DharmaFECT siRNA轉染試劑對細胞進行STAT5 siRNA轉染（50 nM）。ON-TARGETplus Non-targeting siRNA作為陰性對照進行轉染，轉染72 h后Western blot法驗證沉默效率。并根據(jù)研究需要分為6組：未轉染組；轉染陰性對照siRNA組；EGF刺激組；轉染陰性對照siRNA加EGF刺激組；轉染STAT5 siRNA加EGF刺激組；轉染STAT5 siRNA組。

1.2.4 STAT5顯性負突變體（dominant negative mutant,DN）及野生型STAT5的轉染及分組研究 腺病毒介導的Stat5a△740 Stat5a能夠阻斷STAT5的信號通路的激活[4]。待A549細胞鋪滿板底約70%-80%時，準備轉染質粒。取2支EP管，于一管中加入10 μg質粒和500 μL無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基，另一管加入20 μg Lipofectamine 2000和500 μL無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基。兩管混合后，室溫放置30 min，再加1 mL RPMI-1640培養(yǎng)基，混勻。吸出孔板中舊培養(yǎng)基，用無血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌一遍，然后加入已混勻的上述兩種混合液。2 h后，倒掉混合液，更換為含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，轉染72 h后Western blot法驗證轉染效率。并根據(jù)研究需要分為5組：未轉染組；轉染野生型STAT5組；EGF刺激組；轉染STAT5顯性負突變體加EGF刺激組；轉染STAT5 siRNA加EGF刺激組。

1.2.5 轉錄因子結合實驗 將干預后細胞分為如下5組：未轉染組；轉染野生型STAT5組；EGF刺激組；轉染STAT5顯性負突變體加EGF刺激組；轉染STAT5 siRNA加EGF刺激組。根據(jù)試劑盒說明書提取各組細胞核蛋白。使用Bradford蛋白定量試劑盒進行蛋白質濃度測定。根據(jù)文獻[5]指導進行操作。一抗為兔抗人p-STAT5（100 μL/1:100），二抗為HRP標記的羊抗兔抗體（100 μL/1:200）。

1.2.6 Western blot實驗 細胞經(jīng)上述處理后，根據(jù)試劑盒說明書分別提取細胞核蛋白，細胞漿蛋白和總蛋白，首先進行蛋白定量，從每組中取50 μg蛋白提取物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，以5%脫脂奶粉PBS/0.1%Tween20封閉30 min，加入1:1,000倍稀釋的一抗（STAT5或p-STAT5），以β-actin或Histone H1為內(nèi)參，4oC孵育過夜。PBS/0.1% Tween20洗膜后加入二抗室溫孵育2 h。PBS/0.1% Tween20洗膜后ECL發(fā)光，用Chemi-genius凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的表達量。

1.2.7 半定量RT-PCR檢測 細胞經(jīng)過上述處理后，收集細胞，用Trizol試劑一步法提取細胞總RNA。取總RNA 500 ng進行cDNA第一鏈合成，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書合成模板。引物序列如下：COX-2（forward:5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3'; reverse:5'-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3'），β-actin（forward: 5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3'; reverse: 5'-CTCGTCATACTCCTGCヰG-3'）。PCR體系在94oC下變性2 min，循環(huán)條件為94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、30 s，共25個循環(huán)，最后延伸10 min。取產(chǎn)物5 μL通過電泳利用瓊脂糖凝膠進行分離，并在紫外線燈下照相。最后通過凝膠灰度分析儀進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計分析 利用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EGF對肺腺癌A549細胞中STAT5活化的影響 為明確在體外A549細胞中是否存在STAT5的激活，以及EGF是否可以促進STAT5的活化，我們用EGF對細胞刺激后進行了免疫熒光染色。在熒光顯微鏡下，我們發(fā)現(xiàn)在部分未經(jīng)處理的A549細胞中活化的STAT5（p-STAT5）主要位于細胞漿，且處于極低的激活水平，而在部分細胞則無p-STAT5的表達。EGF刺激A549細胞后STAT5部分活化穿梭入細胞核，而且呈高水平激活（圖1）。在未經(jīng)處理的A549細胞中STAT5位于細胞漿內(nèi)，呈高水平表達。EGF刺激A549細胞后細胞漿內(nèi)STAT5的表達無明顯改變（圖2）。經(jīng)Western blot分析，結果顯示，在未經(jīng)處理的A549細胞核中無p-STAT5的表達，而經(jīng)EGF激活后，細胞核中的p-STAT5呈高表達（圖3A）。在EGF刺激A549細胞前后，細胞漿內(nèi)的STAT5均呈高表達，且無明顯差異（圖3B）。

2.2 STAT5 siRNA對A549細胞中STAT5蛋白表達的影響及對COX-2 mRNA表達的影響 Western blot檢測結果表明，與未轉染及轉染陰性對照siRNA的細胞相比，轉染STAT5 siRNA細胞中STAT5蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），提示STAT5 siRNA能明顯阻斷STAT5的表達，而EGF刺激后對STAT5的表達無明顯影響（圖4A）。另一方面，與未轉染及轉染陰性對照siRNA的細胞相比，轉染STAT5 siRNA細胞中COX-2 mRNA的表達明顯降低（P＜0.05）。EGF雖然可以使COX-2 mRNA表達明顯升高，但在轉染STAT5 siRNA細胞中，此作用被明顯削減（P＜0.05，圖4B）。

2.3 野生型STAT5及STAT5顯性負突變體對A549細胞中STAT5、p-STAT5蛋白及COX-2 mRNA表達的影響 Western blot檢測結果表明，與未處理組的細胞相比，轉染野生型STAT5細胞中STAT5蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），而對p-STAT5蛋白表達無明顯影響。轉染STAT5顯性負突變體細胞對STAT5表達無明顯影響，但Western blot可見突變體條帶，而且，轉染STAT5顯性負突變體后，EGF對STAT5的活化作用也被明顯削弱（P＜0.05，圖5A，圖5B），提示STAT5顯性負突變體有阻斷STAT5激活的作用。另一方面，與未轉染的細胞相比，轉染野生型STAT5細胞中COX-2 mRNA的表達明顯升高（P＜0.05），提示非磷酸化的STAT5在A549細胞中有調(diào)節(jié)COX-2表達的作用。轉染STAT5顯性負突變體細胞中，EGF上調(diào)COX-2 mRNA的作用被明顯削弱（P＜0.05，圖5C），提示p-STAT5在A549細胞中同樣具有調(diào)節(jié)COX-2表達的功能。

圖 1 A549細胞和EGF刺激A549細胞后p-STAT5的免疫熒光染色分析。A：p-STAT5在A549細胞中的表達；B：A549細胞的核染色；C：A與B的重疊圖像；D：EGF刺激后p-STAT5在A549細胞中的表達；E：A549細胞的核染色；F：D與E的重疊圖像。Fig 1 Immunofluorescence of p-STAT5 in resting and EGF-stimulated human lung adenocarcinoma A549 cells. Upper panels, no EGF stimulation;lower panels, EGF stimulation. (A) and (D), p-STAT5 staining; (B) and (E), Hoechst33258 staining of nuclei; (C) and (F), merged images.

圖 2 A549細胞和EGF刺激A549細胞后STAT5的免疫熒光染色分析。A：STAT5在A549細胞中的表達；B：A549細胞的核染色；C：A與B的重疊圖像；D：EGF刺激后STAT5在A549細胞中的表達；E：A549細胞的核染色；F：D與E的重疊圖像。Fig 2 Immunofluorescence of STAT5 in resting and EGF-stimulated human lung adenocarcinoma A549 cells. Upper panels, no EGF stimulation;lower panels, EGF stimulation. (A) and (D), STAT5 staining; (B) and (E), Hoechst33258 staining of nuclei; (C) and (F), merged images.

2.4 A549細胞中STAT5表達的變化和STAT5活化對 DNA結合活性的影響 轉錄因子結合實驗結果顯示，與未處理組的細胞相比，EGF刺激后的細胞的STAT5 DNA結合活性明顯升高（P＜0.05）。轉染野生型STAT5的細胞未發(fā)現(xiàn)STAT5 DNA結合活性發(fā)生改變。而轉染STAT5顯性負突變體和STAT5 siRNA的細胞中，EGF對STAT5 DNA結合活性的刺激作用被抑制（圖6）。提示STAT5顯性負突變體和STAT5 siRNA有抑制STAT5 DNA結合活性的作用，從而影響STAT5的轉錄活性。

圖 3 EGF刺激對A549細胞核p-STAT5（A）和細胞漿STAT5（B）表達影響的免疫印跡分析Fig 3 P-STAT5 (A) and STAT5（B) expression induced by EGF in human lung adenocarcinoma A549 cells. Western blot analysis of nucleus extracts from EGF-stimulated and resting A549 human lung adenocarcinoma cells showing upregulation of nucleus p-STAT5 (A) and no significant of cytoplasmic STAT5 (B).

圖 4 A549細胞轉染STAT5 siRNA后以及受到EGF刺激后對STAT5表達影響的免疫印跡分析（A）和COX-2 mRNA表達影響的電泳分析（B）。A549：未轉染組；CtrlsiRNA：轉染陰性對照siRNA組；EGF：EGF刺激組；EGF+CtrlsiRNA：轉染陰性對照siRNA加EGF刺激組；EGF+siRNA：轉染STAT5 siRNA加EGF刺激組；STAT5 siRNA：轉染STAT5 siRNA組。Fig 4 Western blot analysis of STAT5 expression (A) and electrophoresis analysis of COX-2 expression (B) in A549 cells transfected with STAT5 siRNA together with or without EGF stimulation. A549: untransfected; CtrlsiRNA: transfected with control siRNA; EGF: stimulation with EGF;EGF+CtrlsiRNA: transfected with control siRNA and stimulation with EGF; EGF+STAT5 siRNA : transfected with STAT5 siRNA and stimulation with EGF; STAT5 siRNA: transfected with STAT5siRNA.

3 討論

自1992年Fu發(fā)現(xiàn)了信號轉導和轉錄激活因子以來，國內(nèi)外醫(yī)學工作者對STAT家族進行了大量研究，證實STAT家族成員參與了多種細胞因子、生長因子的信號轉導，并調(diào)節(jié)人體免疫反應、炎癥反應和細胞的生長、分化等。研究顯示，在許多惡性腫瘤中，包括白血病[6]、乳腺癌[7]、前列腺癌[8]、頭頸癌[9]及NSCLC[10]中均存在STAT的異常激活。STAT激活后發(fā)生磷酸化，形成二聚體并穿梭入細胞核，入核后的STAT與同源的DNA結合區(qū)域相結合誘導轉錄激活[11]。在NSCLC中已被證實存在STAT酪氨酸磷酸化現(xiàn)象[12]。

圖 5 A549細胞轉染野生型STAT5，STAT5顯性負突變體和STAT5 siRNA后以及受到EGF刺激后對STAT5（A）、p-STAT5（B）表達影響的免疫印跡分析和COX-2 mRNA表達影響的電泳分析（C）。Ctrl：未轉染組；WT-STAT5：轉染野生型STAT5組；EGF：EGF刺激組；EGF+DN-STAT5：轉染STAT5顯性負突變體加EGF刺激組；EGF+STAT5 siRNA：轉染STAT5 siRNA組加EGF刺激組。Fig 5 Western blot analysis of STAT5 (A), p-STAT5 (B) and electrophoresis analysis of COX-2 (C) expression in A549 cells transfected with WT-STAT5,DN-STAT5 and STAT5 siRNA together with or without EGF stimulation. Ctrl, transfected with control adenovirus; WT-STAT5, transfected with wildtype STAT5; EGF, stimulation with EGF; EGF+DN-STAT5, transfected with dominant negative STAT5 and stimulation with EGF; EGF+STAT5 siRNA,transfected with STAT5 siRNA and stimulation with EGF.

在STAT家族的7個成員中，目前研究最為深入和廣泛的是STAT3和STAT5。STAT5分為STAT5a和STAT5b兩種亞型，STAT5位于細胞漿內(nèi)，受細胞因子或生長因子刺激，在酪氨酸激酶，特別是JAK激酶的作用下，其羧基末端結構域的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而使STAT5發(fā)生活化[13]。磷酸化的STAT5形成同源或異源的二聚體，穿梭入細胞核內(nèi)，識別并結合到靶基因特異啟動子的反應元件中[14]。

RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術是用來研究基因功能的最常用工具，屬于轉錄后基因沉默（posttranscriptonal gene silencing, PTGS）。而顯性負突變體是通過顯性負性作用而產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)效應，在蛋白水平起競爭性抑制作用，對目的基因表達無影響，能夠和正常受體競爭結合配體，但是顯性負突變體無信號傳導功能，因此對該受體功能起到抑制作用，并對該受體的表達未造成影響，而siRNA則會導致該受體表達水平下降。因此，siRNA和顯性負突變體是在不同水平起作用的。STAT5是通過磷酸化及去磷酸化來實現(xiàn)其作用的，磷酸化后生成的蛋白量很少，若僅用siRNA來抑制目的基因表達并不能完全闡釋STAT5的功能。而用顯性負突變體則可以代替功能蛋白來研究其缺失后狀態(tài)，并對研究人類癌細胞的基因功能非常有用。STAT5顯性負突變體的特點是使激活域的C末端的部分或完全失活。Stat5a△740是表達負顯性STAT5的質粒，保留了二聚體形成及DNA結合區(qū)域中保守的酪氨酸殘基，可對STAT5a和STAT5b介導的轉錄產(chǎn)生干擾[15]。我們通過對A549細胞進行STAT5顯性負突變體轉染，使細胞過表達顯性負STAT5，從而減弱DNA結合活性，抑制EGF介導的DNA結合活性的增加，以此研究STA5活化后對COX-2的調(diào)節(jié)作用。通過對細胞進行野生型STAT5的轉染可以使STAT5的表達升高，借助此方法，我們可以更深一步地為非磷酸化STAT5對COX-2的調(diào)控作用進行闡釋。

本研究中，通過對A549細胞進行EGF的刺激，STAT5 siRNA、野生型STAT5及STAT5顯性負突變體的轉染，從多層次多角度探討了STAT5對COX-2的調(diào)控作用，從而得出如下結論：EGF的刺激可誘導A549細胞中STAT5的活化，使COX-2 mRNA的表達明顯升高，但STAT5的表達未增加；STAT5 siRNA可抑制STAT5蛋白及COX-2 mRNA的表達，并可削減EGF對STAT5的激活效應；野生型STAT5可使STAT5蛋白和COX-2 mRNA的表達升高，但不能使STAT5發(fā)生活化；STAT5顯性負突變體可削減EGF對STAT5的活化作用和EGF上調(diào)COX-2 mRNA的作用。這些結果提示，在肺腺癌A549細胞中，STAT5的激活參與了COX-2的調(diào)控，而且是COX-2上調(diào)表達的必須條件。另一方面，非磷酸化的STAT5的表達也是COX-2表達的必要條件，其可能通過不依賴于磷酸化和轉錄激活途徑來實現(xiàn)其調(diào)控作用。COX-2表達很可能受非磷酸化STAT5及磷酸化STAT5雙途徑的調(diào)控。據(jù)文獻[16]報道，STAT5可被EGFR家族激酶激活，這也與我們得出的STAT5可以通過EGFR信號通路發(fā)生活化這一結論相符。

圖 6 A549細胞轉染野生型STAT5，STAT5顯性負突變體和STAT5 siRNA后以及受到EGF刺激后對STAT5 DNA結合力表達影響的分析。與其它組相比，*P＜0.05，n=3。Fig 6 STAT5 DNA binding assay in A549 cells nuclei transfected with WT-STAT5, DN-STAT5 and STAT5 siRNA with or without EGF stimulation.Data are means± SEM. *P＜0.05 when compared with the other four groups. n=3.

圖 7 STAT5對COX-2可能存在的兩種調(diào)控機制。STAT5通過磷酸化及非磷酸化雙途徑來實現(xiàn)對COX-2的調(diào)控。Fig 7 Schematic depiction of two different potential mechanisms of regulation. STAT5 regulates COX-2 by pathways dependent of phosphorylation and unphosphorylation.

綜上所述，通過我們研究，有如下新發(fā)現(xiàn)：①在體外A549細胞中STAT5無激活；②EGF能夠誘導STAT5的激活，促使磷酸化的STAT5穿梭入核；③STAT5的激活是EGF誘導COX-2上調(diào)表達的必要條件；④非磷酸化狀態(tài)的STAT5可能通過非轉錄激活的途徑參與了COX-2表達的調(diào)控。更令我們感興趣的是在研究中發(fā)現(xiàn)非磷酸化STAT5也可能參與了COX-2表達的調(diào)控，還有一個尚未明確的信號通路需要我們繼續(xù)去探求。我們可以利用STAT5通過磷酸化及非磷酸化雙途徑來實現(xiàn)對COX-2的調(diào)控（圖7）這一特點，探求一條以STAT5為靶點治療肺腺癌的新途徑，為更多肺腺癌患者的治療尋求到新出路。