王兆峰 劉紅兵 趙仁德 張鶴 劉春花 宋勇

近期發(fā)表的文獻(xiàn)[1]顯示：2012年肺癌的死亡率仍將處于各種腫瘤首位，新發(fā)病例居第二位。在諸多西方國(guó)家，近15年肺癌的發(fā)病率已達(dá)高峰并呈下降趨勢(shì)，而我國(guó)肺癌的發(fā)病率卻呈持續(xù)上升趨勢(shì)[2]。鑒于肺癌高發(fā)病率和死亡率，提高肺癌的診治水平，改善患者預(yù)后已成為亟待解決的難題。近年來(lái)，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）作為最常見的組織病理類型研究較多。生存相關(guān)的研究[3-6]已證實(shí)年齡、KPS評(píng)分、TNM分期等是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素。但是，我們是否可以在進(jìn)行病理診斷的同時(shí)根據(jù)組織標(biāo)本的病理形態(tài)表現(xiàn)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后呢？Mesker、Wang等[7-11]研究表明：在結(jié)直腸癌、乳腺癌、食管鱗癌及食管腺癌等多種實(shí)體瘤內(nèi)，腫瘤組織內(nèi)腫瘤與間質(zhì)的比例（tumor-stroma ratio, TSR）被證明是一種新的、可靠的獨(dú)立預(yù)后因子，且此評(píng)估方法簡(jiǎn)單，切實(shí)可行，重復(fù)性好。但TSR對(duì)NSCLC患者的預(yù)后價(jià)值目前尚無(wú)相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)旨在證實(shí)TSR在NSCLC中的預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 選取南京軍區(qū)南京總醫(yī)院2000年1月-2007年1月手術(shù)切除的經(jīng)常規(guī)病理證實(shí)的NSCLC標(biāo)本73例。73例NSCLC中，男性50例，女性23例；年齡30歲-75歲，中位年齡59歲。所有NSCLC病例術(shù)前未經(jīng)化療和放療，術(shù)后病理證實(shí)為NSCLC（鱗癌35例，腺癌33例，腺鱗癌5例），術(shù)后經(jīng)過2個(gè)-4個(gè)療程的以鉑類為基礎(chǔ)的化療。按照UICC分期委員會(huì)第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，分為I期22例，II期28例，III期23例。

1.2 方法 將術(shù)后組織常規(guī)石蠟包埋，制片成厚度為4 μm切片。采用蘇木素染色法，按常規(guī)程序脫蠟和水化。PBS液沖洗后，用蘇木素（北京中杉金橋公司）進(jìn)行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]判定：常規(guī)鏡檢蘇木素染色后的切片，50×放大倍數(shù)下選取腫瘤浸潤(rùn)最明顯的區(qū)域。常規(guī)認(rèn)為該區(qū)域有兩部分組成：腫瘤細(xì)胞部分和間質(zhì)部分，用百分比表示。然后，在該區(qū)域內(nèi)100×倍放大倍數(shù)下評(píng)估單視野范圍內(nèi)腫瘤細(xì)胞面積所占該視野的百分比（carcinoma percentage, CP），剩余百分比即為間質(zhì)百分比（例：如果腫瘤細(xì)胞面積占該視野40%，間質(zhì)成分面積所占百分比即為60%。取10%為取值區(qū)間，即：20%、30%等），計(jì)算腫瘤內(nèi)部的TSR。選取2個(gè)-4個(gè)視野進(jìn)行評(píng)估，取CP值最低的一個(gè)確定為最終取值。因計(jì)算的為腫瘤內(nèi)部的TSR，故該視野范圍內(nèi)間質(zhì)周圍必須是有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。不能選取間質(zhì)較多，間質(zhì)周圍無(wú)腫瘤細(xì)胞的區(qū)域進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)TSR評(píng)估結(jié)果，選取CP為50%的cut-off值，將病例分為兩組：將CP值＜50%病例定義為間質(zhì)豐富組（stroma-rich group）而CP值≥50%視野定義為間質(zhì)稀少組（stroma-poor group）。以上評(píng)估過程主要由2名病理專家完成，當(dāng)2名專家意見不一致時(shí)根據(jù)第32名病理專家的意見確認(rèn)最終結(jié)果。

1.4 隨訪 患者從手術(shù)日期開始隨訪，至患者死亡結(jié)束，生存者至2012年5月31日終止隨訪。

1.5 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用卡方檢驗(yàn)、Kaplan-Meier生存分析和Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSR在NSCLC組織中的分布 根據(jù)以上試驗(yàn)方法，在73例NSCLC組織中，間質(zhì)豐富組27例，間質(zhì)稀少組46例，比例分別為37%、63%。不同TSR在肺鱗癌及腺癌中病理形態(tài)學(xué)示例如圖1所示。

2.2 TSR分組與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)TSR結(jié)果，間質(zhì)稀少組與間質(zhì)豐富組在性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及pTNM分期間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表1。

2.3 不同TSR分組與NSCLC預(yù)后的關(guān)系 73例NSCLC患者從手術(shù)日期開始隨訪，至患者死亡結(jié)束，未死亡的至2012年5月31日截止隨訪。用Kaplan-Meier生存分析和Logrank檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，TSR兩分組之間OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014），結(jié)果顯示間質(zhì)稀少組患者中位生存時(shí)間為1,169 d，間質(zhì)豐富組的患者中位生存時(shí)間為808 d。間質(zhì)豐富組的患者OS明顯低于間質(zhì)稀少組的患者（圖2）。對(duì)性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、分化程度及TSR分組9個(gè)因素進(jìn)行Cox模型多因素分析（表2）可見，TSR是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素（HR=1.832, 95%CI: 1.017-3.299），pTNM分期也是影響NSCLC獨(dú)立預(yù)后因素（HR=1.953, 95%CI: 1.284-2.970），而性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度均非NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用蘇木素法對(duì)73例NSCLC手術(shù)切除標(biāo)本的TSR進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)TSR評(píng)估結(jié)果，選取CP%為50%的cut-off值，將病例分為兩組：間質(zhì)豐富組（stroma-rich group）和間質(zhì)稀少組（stroma-poor group）。統(tǒng)計(jì)分析顯示：間質(zhì)豐富組患者預(yù)后明顯差于間質(zhì)稀少組，兩組OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014），并證明TSR是NSCLC獨(dú)立的預(yù)后因子（HR=1.832, 95%CI: 1.017-3.299）。該實(shí)驗(yàn)對(duì)TSR在NSCLC中的預(yù)后價(jià)值做出了評(píng)價(jià)。

圖 1 TSR在不同病理類型肺組織中的表達(dá)。A：鱗癌間質(zhì)稀少組；B：腺癌間質(zhì)稀少組；C：鱗癌間質(zhì)豐富組；D：腺癌間質(zhì)豐富組（×100）。Fig 1 The expression of TSR in lung tissue of different kinds of histology. A: The stroma-poor group of squamous cell lung carcinoma; B: The stroma-poor group of lung adenocarcinoma; C: The stroma-rich group of squamous cell lung carcinoma;D: The stroma-poor group of lung adenocarcinoma (×100).

圖 2 73例NSCLC患者Kaplan-Meier生存分析。結(jié)果顯示間質(zhì)稀少組患者中位生存時(shí)間為1,169 d，間質(zhì)豐富組的患者中位生存時(shí)間為808 d。間質(zhì)豐富組的患者OS明顯低于間質(zhì)稀少組的患者（P=0.014）。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis of 73 cases with NSCLC.Results show that the median survival time in the stroma-poor group was 1,169 d, and 808 d in the stroma-rich group. OS days of patients in stroma-rich group were significantly lower than the stroma-poor group (P=0.014). OS: Overall survival.

目前，關(guān)于TSR在實(shí)體瘤中的預(yù)后價(jià)值，研究尚少。荷蘭學(xué)者M(jìn)esker等在前期的研究中發(fā)現(xiàn)：在實(shí)體瘤內(nèi)，與腫瘤組織接觸的間質(zhì)組織可能影響患者的預(yù)后。為進(jìn)一步證實(shí)上述現(xiàn)象，Mesker等[7]用HE染色的方法對(duì)122例I期-III期的結(jié)直腸癌患者手術(shù)組織進(jìn)行病理形態(tài)分析及評(píng)估，并隨訪患者預(yù)后。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：選取CP為50%的cut-off值對(duì)患者進(jìn)行分組，CP≥50%組的患者OS和無(wú)病生存（disease-free survival, DFS）均長(zhǎng)于CP＜50%組。該實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著結(jié)直腸癌分期的遞進(jìn)，CP值越小。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相似，但兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析未見TNM分期與TSR有相關(guān)性，由于兩實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)較少，需要增加樣本量以進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步研究TSR在結(jié)直腸癌中的價(jià)值，Mesker等[10]開展了另一組含135例I期-II期結(jié)直腸癌患者的研究，預(yù)后分析進(jìn)一步證實(shí)了TSR在結(jié)直腸癌中的預(yù)后價(jià)值。Courrech Staal等[9]對(duì)93例食管腺癌術(shù)后組織的TSR進(jìn)行評(píng)估并隨訪患者預(yù)后，發(fā)現(xiàn)CP高組患者的DFS明顯長(zhǎng)于CP低組，并證實(shí)TSR是食管腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素（HR=2.006, 95%CI: 1.181-3.407）。關(guān)于TSR與NSCLC預(yù)后的關(guān)系，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：通過對(duì)73例NSCLC術(shù)后組織切片蘇木素染色后發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)稀少組患者中位生存時(shí)間為1,169 d， 間質(zhì)豐富組的患者中位生存時(shí)間為808 d。間質(zhì)豐富組的患者OS明顯低于間質(zhì)稀少組的患者，多因素Cox回歸分析顯示TSR是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因素（HR=1.832,95%CI: 1.017-3.299），與Mesker等以上研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)TNM分期是NSCLC獨(dú)立的預(yù)后因素，這與以往研究結(jié)論一致。

表 1 TSR與不同臨床病理特征間的關(guān)系Tab 1 The relationship between TSR and different clinical and pathological features

表 2 NSCLC預(yù)后因素多變量Cox回歸分析Tab 2 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors in NSCLC

腫瘤組織是由腫瘤細(xì)胞和復(fù)雜的間質(zhì)組成。在正常組織內(nèi)間質(zhì)具有屏障的作用，但在腫瘤組織內(nèi)，作為腫瘤微環(huán)境的間質(zhì)成分卻對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有易化作用[12]。新近研究[13,14]表明，在腫瘤演進(jìn)過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是一個(gè)重要的決定性過程，此過程通過多個(gè)細(xì)胞內(nèi)通路參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移乃至“干細(xì)胞性”轉(zhuǎn)變等病理過程。在癌變的早期，腫瘤細(xì)胞的增殖未突破基底膜，與周圍間質(zhì)隔開，此為原位癌。當(dāng)原位癌發(fā)展成浸潤(rùn)性癌時(shí)，癌細(xì)胞穿過基底膜侵犯間質(zhì)，誘導(dǎo)正常間質(zhì)轉(zhuǎn)化為“活性間質(zhì)”[15]，此過程促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrixc, ECM ）的沉積[16]，從而擴(kuò)充了腫瘤間質(zhì)。而作為間質(zhì)重要成分的成纖維細(xì)胞，不僅在創(chuàng)傷愈合等多種炎癥反應(yīng)中起作用，而且是腫瘤的關(guān)鍵性特征[17]。近年來(lái)，關(guān)于一種腫瘤間質(zhì)內(nèi)特殊的成纖維細(xì)胞-腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fi broblasts, CAFs）因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的特殊作用而逐漸得到重視。大部分侵襲性腫瘤的間質(zhì)都會(huì)有CAFs，CAFs具有較強(qiáng)的收縮能力，它可以合成ECM，從而刺激上皮細(xì)胞的增值，通過旁分泌不同生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子，如：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor, HGF）、胰島素生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factors, IGF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（neuron growth factor, NGF）等，活化后的CAFs可分泌高水平的細(xì)胞外金屬基質(zhì)蛋白酶，從而促進(jìn)ECM組分的改變，影響上皮腫瘤細(xì)胞的演進(jìn)[18-20]。除了對(duì)原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞的作用，Olaso等[21]研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)活化的CAFs同樣可以促進(jìn)腫瘤的增值。Balsamo等[22]發(fā)現(xiàn)CAFs還能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能以使腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃逸。由以上研究可見，腫瘤組織內(nèi)的間質(zhì)成分通過多種通路參與了腫瘤發(fā)生、增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的過程，從而影響患者的預(yù)后。但CAFs與其它間質(zhì)成分之間如何相互影響，以及EMT與CAFs之間的確切關(guān)系，這些相互作用機(jī)制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間的確切關(guān)系，目前尚未完全清楚。

盡管本實(shí)驗(yàn)對(duì)TSR在NSCLC中的預(yù)后價(jià)值做出了評(píng)價(jià)，但本實(shí)驗(yàn)也存在一些缺陷，如：本實(shí)驗(yàn)主要研究了NSCLC中常見的鱗癌、腺癌及腺鱗癌等病理類型，但NSCLC分型復(fù)雜，僅腺癌就有多種不同分類，形態(tài)學(xué)差異較大，因此有待于擴(kuò)大樣本量，完善病理類型，進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

總之，本研究提示通過組織病理形態(tài)分析有可能為NSCLC患者預(yù)后提供可靠信息，且該方法簡(jiǎn)單可行。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)TSR是NSCLC患者獨(dú)立的預(yù)后因素。但是，關(guān)于TSR與NSCLC之間的機(jī)制關(guān)系尚未完全明確，尚待進(jìn)一步研究。

致謝

感謝南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科涂頻、李萬(wàn)春醫(yī)師在該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)定部分中給予的幫助。