馬玲 劉莉 張濤 單莉

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率與死亡率已躍居首位,約80%的患者為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[1],大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已屬晚期,中位生存時間約8個-10個月,以鉑類為基礎(chǔ)的化療是這部分患者的主要治療手段,但療效似乎已達到平臺期.近年來,小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)等靶向藥物在NSCLC治療中的地位日益突出,尤其是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變的患者,治療效果不亞于化療,且毒副反應(yīng)較輕[2].肺原發(fā)腫瘤組織是檢測EGFR基因突變狀況的主要標本來源,可由氣管鏡或腫物穿刺獲取,但是部分患者由于各種原因并不能獲取腫瘤組織標本,無法進一步檢測EGFR基因突變狀況為EGFR-TKIs治療提供有效依據(jù).本研究旨在探討晚期NSCLC患者血清EGFR基因突變狀況與EGFR-TKIs療效的相關(guān)性.

1 資料與方法

1.1 研究對象 以2010年12月-2011年12月就診于我院一線口服EGFR-TKIs治療的80例晚期NSCLC患者為研究對象,其中男性38例,女性42例,年齡為35歲-78歲,平均(63.2±5.6)歲;均經(jīng)組織學(xué)或細胞學(xué)確診為NSCLC,且行血清EGFR基因突變檢測;經(jīng)pTNM分期為IIIb期-IV期,喪失手術(shù)或放療根治時機;所有患者為拒絕化療或體能狀況差不能接受化療而選擇EGFR-TKIs作為一線治療,其中因患方拒絕化療并要求靶向治療者為21例,因PS評分差無法耐受化療而接受靶向治療者有32例,根據(jù)NCCN指南推薦患者進行靶向治療者有27例;口服吉非替尼患者53例,厄洛替尼27例;治療前檢查無明顯肺間質(zhì)性病變,血常規(guī)及心、肝、腎等重要臟器功能基本正常;所有患者均簽署治療知情及標本留取同意書.

1.2 標本收集及基因檢測 使用帶有血清分離膠的血清管,抽取患者空腹外周靜脈血4 mL,靜置于常溫下,血清管離心3,000 rpm、5 min,分離上清液.使用德國Qiagen生產(chǎn)的血液DNA提取試劑盒提取DNA,無菌蒸餾水對所提取的DNA進行反復(fù)洗脫,分光光度法測定DNA的濃度和純度,-20oC存儲所提取的DNA;采用擴增受阻突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system)方法進行PCR擴增,檢測EGFR基因外顯子19缺失突變和/或外顯子21點突變.用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司EGFR基因突變檢測試劑盒(人類EGFR基因21種突變檢測試劑盒)進行檢測,實驗具體操作步驟參照試劑盒說明書進行.采用StrataGene MX3000P實時PCR儀進行擴增,每次檢測樣品包括1個陽性質(zhì)控品、1個NTC對照.如果Ct值為0或Ct值>30,則實驗結(jié)果判為野生型.所述熒光PCR的反應(yīng)條件:95oC預(yù)變性5 min,1個循環(huán);95oC變性25 s,64oC退火20 s,72oC延伸20 s,15個循環(huán);93oC變性25 s,60oC退火35 s,72oC延伸20 s,31個循環(huán).

1.3 結(jié)局指標及隨訪 每位患者從用藥開始詳細記錄癥狀緩解的時間,出現(xiàn)不良反應(yīng)的時間、程度及耐受情況;所有患者于口服2個月后進行首次評價,行胸片、CT、腫瘤標記物、肝腎功及遠處轉(zhuǎn)移部位的客觀檢查,以后每1個月住院復(fù)查或門診、電話隨訪.根據(jù)實體腫瘤療效評價標準對病灶進行療效評價,分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)和疾病進展(progressive disease, PD),有效率(response rate, RR)=(CR+PR)/總例數(shù)X100%,臨床獲益率(clinical benefit rate, CBR)=(CR+PR+SD)/總例數(shù)X 100%;隨訪患者無進展生存時間(progression free survival,PFS),PFS是指腫瘤患者從接受靶向治療開始,到觀察到疾病進展或者發(fā)生因為任何原因的死亡之間的這段時間;本組研究80例患者,失訪2例,失訪率為2.5%.

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行處理,定性數(shù)據(jù)以百分比進行表示,計數(shù)資料采用χ2檢驗,Kaplan-Meier法繪制生存曲線,當P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 血清EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系 80例患者共檢測到血清EGFR基因突變27例(33.8%),其中女性(47.1%,16/34)高于男性患者(23.9%, 11/46),腺癌(41.4%, 24/58)高于非腺癌患者(13.6%, 3/22),非吸煙患者(46.9%,15/32)高于吸煙患者(25.0%, 12/48),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);27例EGFR基因突變的患者中,外顯子19缺失突變12例(44.4%),而外顯子21點突變15例(55.6%);基因突變狀態(tài)與年齡、臨床分期、PS評分無關(guān)(P>0.05)(表1).

2.2 血清EGFR基因突變與近期療效的關(guān)系 血清EGFR基因突變型患者的RR(55.6%, 15/27)高于野生型患者(17.0%, 9/53),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.370,P<0.001);EGFR基因突變型患者的CBR(92.6%, 25/27)雖高于野生型患者(86.8%, 46/53),但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.086, P=0.438)(表2).

2.3 血清EGFR基因突變與PFS的關(guān)系 末次隨訪時間為2013年1月,中位隨訪時間為7.8(3.5-26)個月;血清EGFR基因突變型患者中位PFS明顯長于野生型患者(9.8個月 vs 5.7個月,P=0.014)(圖1);進一步對突變患者進行分層分析,外顯子19缺失患者的中位PFS優(yōu)于外顯子21點突變的患者,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(11.2個月 vs 8.8個月,P=0.328)(圖2).

3 討論

檢測EGFR基因突變狀態(tài)并預(yù)測晚期NSCLC患者口服EGFR-TKIs的療效已成為定論,EGFR基因突變型的患者的有效率明顯高于野生型患者,且其治療效果不亞于含鉑的兩藥聯(lián)合化療方案[3-5].EGFR基因位于人類7號染色體的短臂上,由188,307個堿基組成,包括28個外顯子,主要是在外顯子18-21上會發(fā)生突變,而這些突變與靶向藥物反應(yīng)性有關(guān),原因可能是這些突變改變了EGFR基因胞內(nèi)ATP結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu),提高了它對靶向藥物的結(jié)合能力[6].目前,雖然已經(jīng)報道發(fā)現(xiàn)30余種突變與藥物反應(yīng)性有關(guān),但主要是外顯子19的缺失突變和外顯子21的點突變.相關(guān)研究[7]顯示,EGFR基因突變在亞裔NSCLC患者中約占30%-40%,在西方人群中約為10%.一項西班牙研究[8]報道,EGFR基因突變中,外顯子19缺失突變率為62.2%,外顯子21點突變率為37.8%.在本研究入組的80例NSCLC患者中,發(fā)生外顯子19缺失突變?yōu)?2例,外顯子21點突變有15例,外顯子19缺失突變率為44.4%(12/27),外顯子21點突變率為55.6%(15/27),與文獻報道范圍略有差異,可能與本組研究樣本量較少有關(guān).通過分層分析,二者經(jīng)EGFR-TKIs治療后的PFS雖有2.4個月的差別(外顯子19缺失突變11.2個月 vs 外顯子21點突變8.8個月),但統(tǒng)計學(xué)沒有明顯差異,提示存在這兩種突變的NSCLC患者均可從一線EGFR-TKIs治療中取得較好的療效.

表 1 血清EGFR基因突變與患者臨床特征關(guān)系[n(%)]Tab 1 The relationship of EGFR mutation statuses in serum and clinical characteristics [n(%)]

目前進行基因檢測都需要通過有創(chuàng)性組織活檢,而且不易重復(fù)獲取,部分患者病理標本獲取率低,限制了靶向治療的應(yīng)用,因此尋找腫瘤組織替代方案用于基因檢測是當前迫切需要解決的問題.研究[9-11]表明,NSCLC患者的胸水、唾液、糞便和血漿中會有少量突變的腫瘤細胞DNA,尤其在患者的外周血中.周小昀等[10]通過檢測170例NSCLC患者外周血清游離DNA中EGFR基因突變情況,發(fā)現(xiàn)全組患者中敏感突變率為35%,應(yīng)用EGFR-TKIs治療的有效率高達83%.本組研究中,80例晚期NSCLC患者血清EGFR突變率為33.8%,而EGFR-TKIs治療有效率為55.6%,明顯低于周小昀等的研究,考慮可能與該研究中腺癌入組率高、研究對象多為EGFR-TKIs治療優(yōu)勢人群有關(guān).Pathak等[12]報道外周血中腫瘤DNA來源有4種可能:①原發(fā)腫瘤釋放的DNA;②外周循環(huán)中腫瘤微轉(zhuǎn)移灶釋放的DNA;③腫瘤細胞的凋亡釋放的DNA;④腫瘤細胞的壞死釋放的DNA.腫瘤患者外周血游離DNA含量比正常人增高10倍.晚期肺癌患者血清游離DNA中可檢測到EGFR突變,而文獻報道的早期肺癌患者檢測到突變較少的原因可能是由于相對于早期肺癌患者,晚期肺癌患者瘤負荷大,轉(zhuǎn)移途徑多,部位廣,通過血行播散的幾率高,因此檢測陽性率更高.本研中IIIb期與IV期患者血清EGFR基因突變率相差無幾,考慮為樣本含量較少,掩蓋了總體的規(guī)律,這尚需大樣本的研究進一步探討.

表 2 血清EGFR基因突變與近期療效的關(guān)系[n (%)]Tab 2 The relationship of EGFR mutation statuses in serum and efficacy [n (%)]

圖 1 血清EGFR基因突變型與野生型患者的PFS曲線Fig 1 The PFS surve of patients with serum EGFR gene mutation and wild-type gene. PFS: progression free survival.

圖 2 血清EGFR基因外顯子19與21突變患者的PFS曲線Fig 2 The PFS curves of patients with serum EGFR exon 19 and 21 mutations

研究[13,14]報道EGFR-TKIs一線治療晚期NSCLC有近40%的客觀有效率,疾病控制率約70%,PFS達到9個月以上,且患者不良反應(yīng)輕微,耐受性較好,安全性良好.吳一龍等[15]研究表明,EGFR基因突變的NSCLC患者,使用EGFR-TKIs治療的PFS明顯高于化療方案.同樣,Sirera等[16]研究中EGFR敏感突變的患者接受EGFR-TKIs治療的總體RR,比接受化療的患者提高2倍-3倍.本研究對80例一線口服EGFR-TKIs治療的晚期NSCLC患者血清EGFR基因突變狀況進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)27例患者血清EGFR基因發(fā)生了突變,突變率為33.8%,其中女性(47.1%, 16/34)高于男性患者(23.9%, 11/46),腺癌(41.4%, 24/58)高于非腺癌患者(13.6%, 3/22),非吸煙(46.9%, 15/32)高于吸煙患者(25.0%, 12/48),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),顯示女性、非吸煙及腺癌患者突變率更高,與IPASS研究[2]報道的結(jié)果相似.本組研究當中,血清EGFR基因突變的晚期NSCLC患者使用EGFR-TKIs治療的RR為55.6%,PFS為9.8個月,而野生型患者的RR為17.0%,PFS為5.7個月,無論是RR還是中位PFS,二者之間均具有統(tǒng)計學(xué)差異,印證了檢測EGFR基因突變對于患者實現(xiàn)個體化治療具有非常重要的意義.

綜上所述,對于組織標本獲取困難,后期需要進行靶向治療的晚期NSCLC患者而言,通過血清標本檢測EGFR基因突變狀況,不失為一種取材方便、痛苦小、簡便易行的方法,可能為為臨床用藥提供依據(jù).