范 悅 王世明 石青青

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科，山西太原 030001

在中國傳統(tǒng)醫(yī)藥中，苦參堿是一種從苦參、山豆根中提取的生物堿，其分子式為C15H24N2O。而苦參堿早被廣泛用于治療病毒性肝炎、肝纖維化、心律失常等疾病[1]。國內(nèi)外研究表明[2]：無論是在體內(nèi)還是體外，苦參堿具有較高的抗腫瘤活性。它可以抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)分化、誘導(dǎo)凋亡、抗轉(zhuǎn)移等作用，同時又具有免疫調(diào)節(jié)、升高白細(xì)胞、緩解癌痛等許多常規(guī)化療藥物所不具備的優(yōu)勢。此外，研究發(fā)現(xiàn)苦參堿誘導(dǎo)了大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬[3]。而自噬與腫瘤關(guān)系密切，同樣在抑制腫瘤中起著非常重要的作用[4-5]。細(xì)胞自噬在輔助化療藥物治療惡性腫瘤方面起著非常重要的作用。本實驗通過研究不同濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞，探討苦參堿對肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞周期以及細(xì)胞自噬的影響，為臨床化療藥物治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

肝癌HepG2細(xì)胞由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院提供?？鄥A（Matrine，廣州白云山明興制藥有限公司）、DMEM 4.5 g/L Glu（Gibco公司）、PBS 液、胎牛血清（美國 Sigma公司）、單丹磺酞戊二胺（MDC）（美國Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO）、熒光顯微鏡（日本 OlympuS公司）、CO2培養(yǎng)箱、離心機（北京醫(yī)用離心機廠）、流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號：FACSCalibur）、電熱恒溫培養(yǎng)箱 （河北省黃石市醫(yī)療器件廠）等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁達(dá)80%時，用胰酶消化處理，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 MTT法 肝癌HepG2細(xì)胞用0.25%胰酶處理制成單細(xì)胞懸液，以每孔約104個細(xì)胞接種于96孔板（每孔100μL）。分別加入不同濃度的苦參堿溶液，使其終濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL，每個濃度設(shè)三個孔。然后在加培養(yǎng)液100 μL，每孔總體積為200 μL，同時設(shè)定空白孔及對照孔。然后放回CO2箱中培養(yǎng)24、36、48 h。分別在各個時間段結(jié)束前4 h加入 MTT（5 mg/mL）溶液 10 μL，反應(yīng) 4 h離心棄上清液。每孔加入DMSO 150 μL振蕩蕩5～10 min。用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm的吸光值。根據(jù)公式計算：腫瘤細(xì)胞增值抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 肝癌HepG2細(xì)胞以5×104/mL接種至6孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的苦參堿，培養(yǎng)36 h后，收集細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀行細(xì)胞周期分析。

1.2.4 單磺酰戊二胺 （monodansylcadaverine，MDC）熒光染色 將DMEM液培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞以1×104/mL接種至12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦參堿，培養(yǎng)36 h棄培養(yǎng)液，用PBS液洗2遍，加入50 μmol/L MDC，37℃孵育10 min染色。 再用 PBS漂洗細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖

MTT測定結(jié)果見圖1，苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)時間-劑量依賴性。見表1?？鄥A0.5、1.0、2.0mg/mL作用于肝癌HepG2細(xì)胞36 h后的抑制率分別：（17.21±2.02）%、（28.25±3.20）%、（38.77±5.58）%。

表1 不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞不同時間的抑制率（±s，%）

表1 不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞不同時間的抑制率（±s，%）

注：同一濃度不同時間比較，P<0.05；同一時間不同濃度比較，P<0.05

濃度 24 h 36 h 48h 0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 12.48±1.22 20.57±2.21 31.58±2.26 17.21±2.02 28.25±3.20 38.77±2.58 24.47±2.20 40.12±2.37 46.76±3.24

2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞36 h后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期見表2。結(jié)果所示：不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞中36 h后，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果表明苦參堿將肝癌HepG2細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G1期。

表2 不同濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞36 h后細(xì)胞周期（±s）

表2 不同濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞36 h后細(xì)胞周期（±s）

注：同一時間不同濃度組之間，分別比較G1期和S期P<0.05，而G2/M期P>0.05

濃度 G1期 S期 G2/M期0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 37.23±1.72 39.42±1.74 42.66±1.35 35.34±2.16 35.26±0.87 34.75±1.27 15.02±1.35 15.36±1.47 14.92±2.03

2.3 MDC染色顯示苦參堿誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬的產(chǎn)生

為了研究苦參堿是否誘導(dǎo)了肝癌HepG2細(xì)胞自噬的產(chǎn)生，本文用熒光鏡觀察MDC染色的肝癌HepG2細(xì)胞，細(xì)胞顯著的形態(tài)學(xué)變化如圖2所示。MDC是自噬泡的特異性標(biāo)記物熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時，胞質(zhì)內(nèi)可見到清晰的點泡狀結(jié)構(gòu)，表明苦參堿誘導(dǎo)了自噬 的產(chǎn)生。

3 討論

原發(fā)性肝癌是惡性程度最高的腫瘤之一。全球男性發(fā)病率位于惡性腫瘤的第5位，死亡率居惡性腫瘤的第2位；全球女性發(fā)病率位于第7位，死亡率位于第6位。全球每年新發(fā)肝癌約75萬人，而我國占半數(shù)以上[6]。由于肝癌具有惡性程度高、病情發(fā)展快、預(yù)后差、死亡率高等特點，多數(shù)就診時已屬晚期。目前手術(shù)治療依然是肝癌的首選，但是肝癌發(fā)病隱匿，確診時能手術(shù)者僅占l0%～15%，因此必須聯(lián)合其他非手術(shù)措施（如化療、生物治療等）進(jìn)行綜合治療，才能有望提高肝癌患者的長期生存率[7]。近年來，苦參堿作為一種新型化療藥物，具有療效顯著、副作用小、毒性低等特點應(yīng)用于臨床。

苦參堿（Matrine）是中藥苦參、山豆根、苦豆子的主要活性成分，具有保護肝細(xì)胞、抗病毒、抗過敏等多種藥理作用[8]。此外苦參堿具有廣泛的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)：在體外實驗中苦參堿可明顯地誘導(dǎo)人乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]及肝癌細(xì)胞[11]等的凋亡。苦參堿的抗腫瘤的作用機制很多，主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及細(xì)胞毒等多種作用[3，12-13]。本實驗結(jié)果表明：苦參堿對人肝癌HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用，不同濃度的苦參堿作用不同時間后，肝癌細(xì)胞的存活率降低，這種抑制作用呈時間和劑量依賴性。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果：苦參堿作用于人肝癌HepG2細(xì)胞后，G1期細(xì)胞數(shù)目明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)目減少（P<0.05），這表明苦參堿作用肝癌細(xì)胞后將細(xì)胞周期阻滯在G1期，使細(xì)胞不能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，并最終抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的抑制，本文實驗結(jié)果與以往郭丹等[14]、夏寶妹等[15]、楊道科等[16]在肝癌、子宮內(nèi)膜癌以及結(jié)腸癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致。同時熒光顯微鏡檢測：苦參堿誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬泡的產(chǎn)生，這表明自噬參與了苦參堿抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，可能提示苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞后，自噬多發(fā)生在細(xì)胞周期的G1期。而自噬作為一把雙刃劍，它與腫瘤之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，既可以促進(jìn)腫瘤的生長，也可以誘導(dǎo)腫瘤的生長，在本實驗研究中認(rèn)為它參與了苦參堿抑制肝癌細(xì)胞的增殖。本文在既往研究的基礎(chǔ)上，探討了苦參堿對人肝癌HepG2增殖及其細(xì)胞自噬的影響，而其發(fā)生的信號通路及其作用機制仍需作進(jìn)一步的研究。希望本實驗研究能為細(xì)胞周期與腫瘤的增值、分化等之間的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)，為臨床進(jìn)一步更好的治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。

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