張慶慧 黃佩芝 梅金平 劉 洋 余 洋 趙煒疆▲

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心，廣東汕頭 515041;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 300193

神經(jīng)調(diào)節(jié)因子Neuregulin－1 （Nrg1）最初從乳腺癌腫瘤細(xì)胞中提取，是NRG1基因選擇性剪切編碼的類表皮生長(zhǎng)因子家族重要成員之一[1]；Nrg1又稱作膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（GGF），從牛腦和垂體中提取，體外條件下具有促有絲分裂活性[2]。 Nrg1基因選擇性剪切產(chǎn)生至少6種Nrg1異形體，其中最主要的有Ⅰ到Ⅲ型Nrg1[3]。

ErbB3和ErbB4受體可直接與Nrg1發(fā)生作用，作用形式包括同二聚體：ErbB3/ErbB3和ErbB4/ErbB4以及異二聚體形式：ErbB3/ErbB2和ErbB4/ErbB2[4]。Nrg1與其受體相互作用可激活 ERK、AKT、MAPK， PI3γ、PKC 和 Jak-STAT信號(hào)，進(jìn)而引起細(xì)胞周期改變、細(xì)胞分化、抗凋亡程序啟動(dòng)和腫瘤形成[5-7]。在發(fā)育中的大鼠腦組織中，Nrg1的表達(dá)可見(jiàn)于灰質(zhì)、下丘腦以及小腦。成年期，Nrg1則表達(dá)于更廣泛的腦組織區(qū)域，包括下丘腦、海馬、基底節(jié)以及腦干[7-8]。 Nrg1與其受體ErbB2，ErbB3和ErbB4二聚體復(fù)合物相互所用，參與了一系列生物學(xué)過(guò)程[9-12]。 有報(bào)道，Nrg1受體表達(dá)于下丘腦星形細(xì)胞，在Nrg1旁分泌作用下激活，分泌前列腺素E2，進(jìn)而刺激黃體生成素釋放激素（LHRH）的釋放，參與性成熟[7-8]。新近研究發(fā)現(xiàn)，Nrg1可表達(dá)于垂體促性腺激素細(xì)胞，并以鄰分泌方式激活泌乳素細(xì)胞表面受體磷酸化，促進(jìn)泌乳素釋放[10-12]。 體外條件下，Nrg1還可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲，通過(guò)自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13-14]。

Nrg1已用于恒河猴體內(nèi)疾病模型研究，如心律失常誘導(dǎo)的心功能衰竭，且重組Nrg1可增加健康獼猴心臟體積[15-17]。Nrg1還可通過(guò)提高PKB和Bcl-xl活性來(lái)對(duì)抗恒河猴心臟衰竭過(guò)程中心動(dòng)過(guò)速誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[16]。此外，Nrg1受體ErbB2，ErbB3及 ErbB4 mRNA表達(dá)可廣泛見(jiàn)于青年及成年期恒河猴大腦組織[17]。本研究比較觀察Nrg1及其受體ErbB2、ErbB4在成年期恒河猴大腦及小腦灰質(zhì)、白質(zhì)中表達(dá)與分布，從而促進(jìn)對(duì)Nrg1/ErbB信號(hào)通路在大腦、小腦中功能的了解。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠抗Nrg1抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，兔抗ErbB2及兔抗ErbB4抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗小鼠DylightTM488及山羊抗兔DylighTMt594購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司。DAPI染液及抗熒光衰減封片劑購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。蘇木精及伊紅染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。含有恒河猴大腦及小腦組織的組織芯片購(gòu)自陜西超英生物技術(shù)有限公司。

1.2 HE染色

4 μm厚恒河猴垂體組織微陣列切片脫蠟、水化，然后入蘇木精液染色約2 min，1%鹽酸酒精分化；之后行伊紅染色，脫水、透明及中性樹(shù)膠封片。

1.3 免疫熒光染色

4 μm厚恒河猴組織微陣列切片脫蠟、水化，然后入pH 9.0枸櫞酸鹽緩沖液中80℃抗原修復(fù)50 min。室溫冷卻后，切片入PBS中浸泡5 min，10%驢血清室溫封閉60 min，然后加入小鼠抗Nrg1以及兔抗ErbB2抗體或小鼠抗Nrg1及兔抗ErbB4抗體（稀釋比例分別為1∶100）混合液4℃孵育過(guò)夜。 PBS洗后，加驢抗小鼠DylightTM488二抗和山羊抗兔DylightTM594二抗（稀釋度均為1∶500）混合液于切片上，室溫孵育1 h。PBS輕洗后行DAPI染色5 min，PBS充分洗滌，并使用抗熒光衰減封片液封片，熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss，AXIO IMAGER Z1）下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 Nrg1及其受體ErbB2、ErbB4在恒河猴大腦皮質(zhì)及白質(zhì)中表達(dá)與分布

H&E染色顯示恒河猴大腦皮質(zhì)（圖1-A）及白質(zhì)基本結(jié)構(gòu) （圖1-B）。免疫熒光雙標(biāo)法顯示Nrg1可與其受體ErbB2或ErbB4可共位表達(dá)于恒河猴大腦皮質(zhì)部分細(xì)胞胞體中，且均呈密集點(diǎn)狀分布（圖2）；而在大腦白質(zhì)神經(jīng)纖維集中區(qū)域三種分子均有分布，但Nrg1僅與ErbB4存在明顯共定位（圖3）。

2.2 Nrg1及其受體ErbB4在恒河猴小腦皮質(zhì)及白質(zhì)中表達(dá)與分布

H&E染色顯示恒河猴小腦皮質(zhì)（圖4-A）及白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)（圖4-B）。免疫熒光顯示Nrg1主要表達(dá)于小腦數(shù)量較多的顆粒細(xì)胞中并廣泛分布于白質(zhì)神經(jīng)纖維，熒光雙標(biāo)顯示Nrg1與其受體ErbB2可共定位于顆粒細(xì)胞及白質(zhì)神經(jīng)纖維。其受體ErbB4在小腦皮質(zhì)及白質(zhì)中無(wú)明顯表達(dá)和分布，未見(jiàn)與Nrg1存在明顯共定位（圖5）。

3 討論

Nrg1/ErbB受體通路在器官發(fā)育、細(xì)胞分化以及腫瘤發(fā)生中具有重要作用。有報(bào)道，Nrg1參與下丘腦神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞間通訊，促進(jìn)下丘腦LHRH釋放，從而誘導(dǎo)大鼠垂體促性腺激素釋放和正常性成熟[7]。以往研究發(fā)現(xiàn)重組Nrg1α可誘導(dǎo)垂體細(xì)胞ErbB3受體磷酸化以及ErbB3受體的內(nèi)源性磷酸化激活[18]，提示Nrg1/ErbB受體通路可能是多種生理和病理?xiàng)l件下重要信號(hào)通路的起點(diǎn)，此外還發(fā)現(xiàn)Nrg1與其受體ErbB4可部分表達(dá)于恒河猴垂體前葉兩鄰近細(xì)胞中[11]，說(shuō)明在高等動(dòng)物垂體組織中存在以Nrg1及其受體信號(hào)通路為基礎(chǔ)的旁分泌和鄰分泌機(jī)制。因此，明確高等動(dòng)物中Nrg1及其受體表達(dá)與分布，對(duì)進(jìn)一步研究Nrg1/ErbB受體信號(hào)在高等動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)在恒河猴皮質(zhì)Nrg1與ErbB2及ErbB4均存在明顯共定位，提示Nrg1/ErbB受體信號(hào)通路在成年高等動(dòng)物腦組織中具有重要作用，且Nrg1信號(hào)通路可能是以旁分泌或自分泌方式，通過(guò)ErbB2/ErbB4或ErbB4/ErbB4受體復(fù)合物實(shí)現(xiàn)的。在大腦白質(zhì)神經(jīng)纖維中僅觀察到Nrg1與ErbB4共定位，表明在白質(zhì)ErbB4/ErbB4是介導(dǎo)Nrg1功能的主要受體復(fù)合物形式。與大腦皮質(zhì)及白質(zhì)不同，小腦皮質(zhì)及白質(zhì)主要表達(dá)ErbB2,并與Nrg1共定位。這一結(jié)果提示，在恒河猴小腦中ErbB2/ErbB4不是介導(dǎo)Nrg1功能的主要受體復(fù)合物形式，ErbB2可能與表皮生長(zhǎng)因子受體家族其他成員如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）共同組成受體復(fù)合物介導(dǎo)Nrg1的功能，這一假設(shè)有待進(jìn)一步研究支持。

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