王亞媛，高 薇，王 燕，馮 欣

類風濕關節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性疾病，以滑膜增生和外周關節(jié)對稱性、侵蝕性關節(jié)炎為主要特征，是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病。RA早期主要表現(xiàn)為關節(jié)的紅腫熱痛以及功能障礙，最終可能會導致關節(jié)的畸形甚至患者的殘疾。它不僅患病率高，而且致殘率亦高，是造成人群勞動力喪失的主要疾病之一。其病因與發(fā)病機制，即在RA中炎癥和關節(jié)損害是如何發(fā)展和慢性持續(xù)的仍舊是未知的。但是已經(jīng)有相關研究表明信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在RA的發(fā)病過程中會有持續(xù)表達，造成滑膜的持續(xù)性炎癥。然而目前尚無理想的治療手段，因此進一步尋找治療RA的有效方法是亟待解決的難題。

本實驗通過構建靶向STAT3的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉染進入人RA成纖維樣滑膜細胞 (fibroblast－like synoviocytes，F(xiàn)LS)，從而觀察FLS的一系列生理變化、轉染的效率及其抑制率，從而為下一步實施動物造模實驗提供理論依據(jù)，進一步揭示STAT3在RA發(fā)病中的作用，為未來RA的基因治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 滑膜組織 本實驗用的滑膜組織由遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨關節(jié)科提供，患者為2012年2—12月行關節(jié)鏡滑膜切除的RA患者，診斷均符合1987年美國風濕病學會 (ARA)修訂的RA的診斷標準。術前獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Hyclone公司;Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶均購自Sigma公司;Trizol和LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司;聚合酶鏈反應 (PCR)引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，反轉錄聚合酶鏈反應 (RT－PCR)試劑盒購自寶生物工程 (大連)有限公司;兔抗人STAT3抗體、羊抗兔抗體(二抗)均購自Santa Cruz公司;靶向STAT3的siRNA干擾質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司設計構建，共有3個干擾靶序列，分別為 stat3－siRNA－1:5'－TGACCAACAATCCCAAGAA－3';stat3－siRNA－2:5'－ACAATCTACGAAGAATCAA－3';stat3－siRNA－3:5'－TGAAATCATCATGGGCTAT －3'。

1.3 方法

1.3.1 RA FLS的培養(yǎng) 在無菌條件下取滑膜組織，用磷酸鹽緩沖液 (PBS)反復沖洗4～5次以去除血污，剔除周圍的脂肪組織。然后用眼科剪子將滑膜組織切割為1～2 mm3的小塊，用Ⅱ型膠原酶終濃度為0.4%的DMEM培養(yǎng)基，于37℃5%二氧化碳 (CO2)培養(yǎng)箱中孵育消化2 h，然后以1 000 r/min(離心半徑為13.8 cm)離心5 min，收集細胞，棄掉上清液，加入0.25%胰蛋白酶4 ml，再于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中消化30 min。用200目紗網(wǎng)過濾后離心，棄上清液。用10%胎牛血清－DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，移入培養(yǎng)瓶內，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，棄去未貼壁細胞。此時，貼壁的細胞即為原代FLS。待FLS達80%匯合成片時，消化傳代，本實驗用3～7代的細胞。

1.3.2 siRNA轉染細胞 轉染前將2×105個FLS接種于96孔培養(yǎng)皿中，待細胞融合達到80%～90%。按照Invitrogen公司的LipofectamineTM2000轉染試劑操作說明書進行轉染操作。轉染后10～12 h換為10%胎牛血清－DMEM培養(yǎng)基。本實驗細胞分為5組:空白組 (正常培養(yǎng)的FLS)、陰性對照組 (即加入空白質粒的FLS)、RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組，后3個組均加入靶向siRNA的重組質粒，即stat3－siRNA干擾，分別針對3個不同的靶點。按照分組情況，分別于FLS轉染后的24、48、72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染細胞綠色熒光的表達，按發(fā)生綠色熒光的細胞數(shù)占細胞總數(shù)的比例來估計其轉染效率。

1.3.3 轉染后RT－PCR檢測靶基因的mRNA表達水平 根據(jù)STAT3的3個等位基因同源區(qū)設計其引物，上游為5'－CTACAGTGACAGCTTCCCAATG －3'，下游為5'－TTGGCTTCTCAAGATACCTGCT－3'，擴增產(chǎn)物長度為233 bp。用 Trizol提取各組細胞總RNA，按RT－PCR試劑盒說明，取RNA樣品進行反轉錄以及PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)進行條帶分析，測出各組表達率 (即各條帶的灰度值/β－actin條帶灰度值×100%)，然后計算抑制率(抑制率 =1－表達率)。反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性50 s;54℃退火50 s;72℃延伸1 min;擴增34個循環(huán);最后72℃延伸8 min。取反應液5 μl進行電泳。

1.3.4 免疫印跡 (Western blotting)法檢測干擾后STAT3的表達 將細胞裂解，提取各組細胞的總蛋白質，蛋白定量并制樣。將樣品加入制備好的10%聚丙烯酰胺凝膠 (SDS－PAGE)中，電泳分離蛋白質。分離的蛋白質經(jīng)電泳轉移至聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)后，用5%的脫脂奶粉封閉2 h后加入兔抗人STAT3抗體 (1∶500)，4℃搖床孵育過夜。洗膜后以1∶1 000稀釋的相應的堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，再用TBST洗3次，5 min/次。最后進行增強化學發(fā)光法 (ECL)顯色，以各組電泳條帶的灰度值作為條帶的強度指標，內參照β－actin表達條帶的灰度值作為標準，二者的比值代表各組STAT3的表達率，然后根據(jù)1－表達率得到表達抑制率。

1.3.5 四甲基偶氮唑藍 (MTT)法檢測靶向抑制STAT3對FLS增殖的影響 取對數(shù)生長期的人FLS接種于96孔板，每孔104個細胞。每板分3組，每組10孔，共接種5板。第1組為空白組，第2組為陰性對照組，第3組為轉染后確定的最佳干擾序列組 (RNAi－1組)，即RNAi組。5個板分別于接種后培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃溫箱繼續(xù)孵育4 h，離心后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μl二甲基亞砜 (DMSO)，室溫下避光震蕩孵育10 min，使結晶充分溶解，用酶標儀測量各孔490 nm處的吸光度 (A)值，間接反映活細胞數(shù)量，以此作為觀察FLS增殖情況的指標。以時間為橫軸、A為縱軸繪制增殖曲線。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計檢驗。計量資料以 ((±s)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 stat3－siRNA對RA FLS的轉染效率 轉染后在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到，被轉染的細胞有綠色熒光表達，而未被質粒轉染的細胞則沒有熒光表達。其中在轉染48 h時熒光表達較強，轉染細胞數(shù)量最多，72 h后熒光表達開始減弱。

2.2 轉染后STAT3 mRNA的表達情況 RT－PCR分析結果見圖1。在轉染RA FLS后，空白組、陰性對照組、RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組STAT3 mRNA表達抑制率分別為(27.32±2.06)%、 (30.61±2.47)%、 (76.99±2.05)%、(72.75±1.74)%和 (66.50±2.47)%，5組間差異有統(tǒng)計學意義 (F=362.92，P＜0.01);其中空白組與陰性對照組STAT3 mRNA表達抑制率間差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.094);RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組STAT3 mRNA表達抑制率與空白組、陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);且3組STAT3 mRNA表達抑制率依次降低，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。

圖1 RT－PCR檢測轉染后各組STAT3 mRNA的表達Figure1 Expression of STAT3 mRNA in each group detected by RT－PCR

2.3 轉染后STAT3的表達 Western blotting檢測結果見圖2，發(fā)現(xiàn)STAT3表達水平受到不同程度的抑制，其中空白組、陰性對照組、RNAi－1組、RNAi－2組和RNAi－3組STAT3表達抑制率分別為 (44.35±2.04)%、 (43.10±2.59)%、(83.57±1.56)%、(77.05±0.54)%和 (69.44±2.76)%，5組間差異有統(tǒng)計學意義 (F=248.08，P＜0.01);其中空白組、陰性對照組STAT3表達抑制率間差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.472);RNAi－1組、RNAi－2組、RNAi－3組 STAT3表達抑制率與空白組、陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);且3組STAT3表達抑制率依次降低，組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。STAT3的表達與其mRNA的表達情況相符，證明RNAi－1組的干擾效果高于另外兩組。故后續(xù)實驗中所使用的均為RNAi－1組質粒轉染過的FLS。

圖2 Western blotting檢測各組轉染后STAT3的表達率Figure2 Expression of STAT3 detected by Western blotting

2.4 靶向抑制STAT3對FLS增殖的影響 經(jīng)過不同時間點的檢測，空白組、陰性對照組以及RNAi組在490 nm處的A值分別為 (0.553 3±0.343 2)、(0.535 0±0.337 3)和 (0.158 3±0.079 4)，3組間差異有統(tǒng)計學意義 (F=3.761，P=0.047)。其中空白組A值與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義 (P=0.912);RNAi組A值與空白組、陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P值分別為0.028和0.035，見圖3)。

3 討論

盡管RA的病因以及發(fā)病機制尚未完全明確，但是有研究證實細胞因子在RA的發(fā)生過程中起到了核心的致病作用。RA患者的滑膜炎癥中有重要生物學作用的細胞因子，如γ干擾素 (IFN－γ)、白介素 (IL) －2、IL－4、IL－6、IL－7、IL－10、IL－12、IL－15等均通過JAK－STAT信號轉導通路發(fā)揮作用［1－2］，最終導致FLS增殖與凋亡的失衡。而JAKSTAT通路是一個重要的細胞因子信號轉導通路，在調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調節(jié)、炎癥、腫瘤等多種病理生理過程中發(fā)揮重要的作用。因此，其調控的基因也包括多個方面:凋亡相關基因如Fas、Bcl－2、Bax;炎癥相關基因如環(huán)氧合酶2(COX －2)、IL－6、IL －8、內皮素 －1［3］、還原型輔酶Ⅱ (NADPH)氧化酶［4］等。然而，許多在RA中表達顯著升高的細胞因子，如IL－6、IL－15、粒－巨噬細胞集落刺激因子 (GM－CSF)等都是通過激活JAK－STAT通路中的STAT3來發(fā)揮其生物學效應的。而STAT3在FLS的增殖、破骨細胞和Th17細胞的誘導以及RANKL途徑的表達中都是必須的［5－7］。在小鼠的膠原誘導關節(jié)炎 (CIA)模型中已經(jīng)證實，IL－6、IL－1、腫瘤壞死因子α(TNF－α)等促炎細胞因子直接或者間接地激活STAT3，最終導致關節(jié)的持續(xù)性炎癥和破壞［8］。由此可見，STAT3在RA的慢性炎癥和關節(jié)的破壞中都是重要的調節(jié)因子。因此，如果能選擇性地阻斷STAT3的表達，可能會對RA具有潛在的治療作用。

圖3 各組FLS的增殖曲線Figure3 Proliferation curves of FLS in different groups

RNA干擾 (RNA interference，RNAi)技術是近年來備受關注的一個分子生物學技術，是將與某一mRNA序列相對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA導入到細胞中，使與其同源互補的mRNA降解，抑制細胞特定基因的表達，又稱為基因沉默。RNAi具有高效性、特異性、ATP依賴性、位置效應等特點［9］。因此，本實驗通過RNAi技術選擇性地沉默STAT3，使STAT3的表達受到了抑制，同時也就是阻斷了這些炎性遞質表達的共同通路。結果顯示，RNAi－1組、RNAi－2組、RNAi－3組STAT3 mRNA表達受到了一定的抑制，并且其蛋白質水平的表達也受到了抑制，二者的抑制結果及程度一致。轉染后的FLS生長受到了抑制，同時間檢測其活細胞的數(shù)量明顯少于空白組及陰性對照組，生長速度亦較這兩組緩慢。由此，可以進一步明確RA的發(fā)病機制，同時為RA的基因治療提供理論基礎和實驗依據(jù)。

由于目前尚無完全滿意的治療RA的方法，而基因治療是目前治療RA最具有前景的方法，并且基因治療的方法在治療關節(jié)炎和相關的關節(jié)紊亂中已經(jīng)有所發(fā)展，許多動物實驗已經(jīng)證明其具有很高的療效性，并且一些臨床試驗也證明了該法是安全的［10－12］。細胞因子通過其過度表達導致RA的持續(xù)性炎癥和關節(jié)破壞，從而引起了患者身體功能受損以及關節(jié)的疼痛，都會使患者的日常生活活動受到限制，生活質量降低。因此，推測通過基因治療的方法特異性地阻斷JAK－STAT通路將能夠達到改善RA病理過程的目的，從而改善RA患者的生活質量。未來可以研究針對該通路的特異性拮抗劑或者抑制劑，從而為RA的診斷以及治療提供新的靶點和研究方向。

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