徐建亞， 徐 珊， 陳 超， 李佳曦， 單進軍， 汪受傳

(南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院兒科研究所，江蘇南京210046)

呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncyntial Virus，RSV)是引起嬰幼兒下呼吸道感染的主要病原，可導致嬰幼兒感染肺炎和支氣管炎［1］。目前臨床上治療或預防RSV疾病的藥物主要是核苷類似物利巴韋林 (病毒唑)與帕利珠單抗，但均有其局限性［2］。

金欣口服液 (麻黃、苦杏仁、生石膏、葶藶子、桑白皮、前胡、黃芩、虎杖組成)，由南京中醫(yī)藥大學博導、中醫(yī)兒科名醫(yī)汪受傳教授領銜研制，治療RSV肺炎療效顯著優(yōu)于利巴韋林注射液且臨床使用安全［3］。為了探索金欣口服液治療RSV肺炎的物質(zhì)基礎，前期本課題組研究了黃芩(復方組分之一)的主要有效成分黃芩苷對RSV復制周期的影響，發(fā)現(xiàn)黃芩苷不能抑制RSV的復制、轉(zhuǎn)錄及融合［4］。金欣口服液另一主要組分是具抗病毒、抗菌作用的清熱解毒中藥虎杖。國內(nèi)外大量文獻報道，虎杖的主要活性成分白藜蘆醇 (Resveratrol)除抗腫瘤等生物活性外，還有抗病毒、抗炎等作用［5-6］。Drago等［7］研究表明白藜蘆醇具有抗RSV的作用，而關文達等［8］研究結(jié)果相反。

為進一步探討金欣口服液藥效物質(zhì)基礎，研究白藜蘆醇的抗RSV活性及其作用機制，從RSV感染周期角度開展了以下相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料 Hep-2(人喉癌上皮細胞)，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Hep-2采用含10%小牛血清 (FCS)的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。

RSV(Long株)，武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，于Hep-2細胞上擴增。以細胞病變法測定RSV半數(shù)細胞感染量 (TCID50)［4］。

白藜蘆醇，中國藥品生物制品檢定所，批號:111535-200502，純度95%以上。RSV的F蛋白抗體 (小鼠抗人)，F(xiàn)luor Alex488標記二抗 (羊抗小鼠)，Invitrogen公司。RSV核酸測定試劑盒，上海之江生物科技有限公司。 ［3H］CTP(-20 Ci/mmol)，MA 02118，Boslon公司。

1.2 白藜蘆醇對Hep-2的最大無毒濃度測定(MTT法) Hep-2于96孔板中長成單層后，漂洗后加白藜蘆醇藥液100 μL(5個濃度，分別為100、50、25、10、1 μmol/L;正常對照組換維持液)，培養(yǎng)、觀察細胞病變至72 h，并以MTT法測定白藜蘆醇對Hep-2的最大無毒濃度。

1.3 白藜蘆醇對RSV復制的影響 (RT-qPCR法)Hep-2于6孔板中生長并分組:正常對照組、RSV感染模型組、白藜蘆醇干預組，分別簡稱正常組、病毒組、白藜蘆醇組。至細胞數(shù)達5×107以上時，接種0.2 mL 100 TCID50的RSV液 (正常組除外)。吸附1.5h后 (37℃)，正常組、病毒組分別加全培3 mL，白藜蘆醇組加25 μmol/L藥液3 mL，培養(yǎng)24 h后收集細胞，裂解、提取總RNA，qPCR法檢測RSV mRNA水平。具體參照文獻［4］。

1.4 白藜蘆醇對RSV的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)活性的影響 (體外轉(zhuǎn)錄法) 病毒感染及藥物干預后的Hep-2分組基本同1.3項所述，只是改“藥液中培養(yǎng)24 h后收集細胞”為藥物干預19 h后再以2 μg/mL放線菌素D處理1 h再收集細胞，分離病毒核糖體復合體 (RNP complex)進行體外轉(zhuǎn)錄，最后用同位素法測定mRNA全長轉(zhuǎn)錄本含量。具體步驟參照Stephen的RSV poly(A)捕獲法［4，9］。轉(zhuǎn)錄摻入的放射性核苷酸 ［3H］CTP的強度用多功能微孔板檢測儀 (芬蘭HideX，Chameleon V型)檢測。放射強度與體外轉(zhuǎn)錄的mRNA全長轉(zhuǎn)錄本水平正相關，而轉(zhuǎn)錄本水平越高說明RdRP的實際轉(zhuǎn)錄活性越高。

1.5 白藜蘆醇對RSV介導的細胞融合效應的影響(IF/LSCM法) 制作Hep-2細胞爬片，培養(yǎng)18 h后接種100 TCID50RSV液0.2 mL(正常組不接種病毒)。吸附1.5 h后棄病毒液，除白藜蘆醇組加25 μmol/L藥液1 mL外，其余組均加培養(yǎng)液1 mL，培養(yǎng)48 h后進行免疫熒光標記 (IF)及激光掃描共聚焦顯微鏡 (LSCM)觀察，具體參照文獻［4］。

1.6 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。P＜0.05認為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對Hep-2細胞的最大無毒濃度 經(jīng)細胞病變法及MTT法測定，白藜蘆醇對Hep-2細胞的最大無毒濃度為25 μmol/L，其他實驗中均以該濃度作為白藜蘆醇的終濃度。

2.2 白藜蘆醇對RSV核酸復制的影響 RT-qPCR結(jié)果如下:與正常組相比，病毒組mRNA水平顯著升高 (P＜0.001)，表明病毒感染模型成功。與病毒模型組比較，25 μmol/L白藜蘆醇對病毒mRNA水平無顯著影響 (表1)。

表1 qPCR法測定RSV mRNA水平 (n=3，±s)Tab.1 Absolute level for RSV by qPCR(n=3，±s)

表1 qPCR法測定RSV mRNA水平 (n=3，±s)Tab.1 Absolute level for RSV by qPCR(n=3，±s)

注:與正常組比較，*P＜0.001。

組別 RSV mRNA量 (×106)正常組0.001±0.000 02病毒組 2.023±0.034*白藜蘆醇 (25 μmol/L)組2.155±0.090

2.3 白藜蘆醇對RdRP活性的影響 病毒組與正常組相比較，放射性核苷酸輻射強度顯著升高，25 μmol/L白藜蘆醇作用于RSV感染細胞后，輻射強度顯著降低 (圖1)。

圖1 白藜蘆醇對放射強度的影響Fig.1 Effect of resveratrol on intensity of radiation

2.4 白藜蘆醇對RSV介導的細胞融合的影響 IF結(jié)合LSCM實驗結(jié)果如下:病毒組大面積融合形成典型融合大胞且綠色熒光強度高，表明細胞表達F蛋白量多;25 μmol/L白藜蘆醇作用后，熒光強度減弱但不顯著，表明F蛋白表達量稍減少，仍形成典型融合胞。正常組，無綠色熒光、無細胞融合。

3 討論

白藜蘆醇 (resveratrol)，一種天然活性成分，化學名為3，4'，5-三羥基-二苯乙烯，最早從毛葉藜蘆Veratrum grandiflorum中分離得到，是虎杖的主要活性成分之一。《中國藥典》確定其為虎杖的有效成分和質(zhì)控指標之一。近年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有多種生物學活性，其中不少研究表明其具有抗呼吸道病毒活性 (如甲 1 型流感病毒［10］、RSV［7］)。但關文達等［8］研究表明白藜蘆醇 (8.3 μg/mL)于體外抑制腺病毒7型作用，對RSV long株未見明顯抑制作用。以上白藜蘆醇抗RSV相關研究均僅限于細胞病變抑制法 (CPE)觀察抗病毒效應。本課題組采用該方法研究結(jié)果表明白藜蘆醇 (25 μmol/L相當于5.7 μg/mL)對RSV感染的 Hep-2病變具有抑制作用 (另文發(fā)表)。分析原因可能與關文達等采用的A549細胞與Hep-2相比對RSV的敏感性較差相關。

RSV感染細胞時，首先與細胞黏附，后與細胞融合并侵入細胞內(nèi)，進行核酸復制、轉(zhuǎn)錄及翻譯其核衣殼蛋白，最后裝配及從細胞內(nèi)釋放子代病毒，以上過程組成其生命周期，其中任何一個階段都是潛在的抗病毒靶標［11］。

本課題組前期研究證實了金欣口服液能抑制RSV介導的細胞融合，途徑之一是通過調(diào)節(jié)RSV的F蛋白表達［12］，但是該復方的主要組分之一——黃芩，其有效成分黃芩苷對RSV復制相關周期無顯著作用［4］。本實驗中采用相同方法研究了白藜蘆醇對RSV復制、轉(zhuǎn)錄及融合的影響:首先采用RT-qPCR技術檢測RSV的特異性RNA核酸片段，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預病毒感染后的細胞對RSV核酸水平無明顯影響，即白藜蘆醇不能抑制RSV在細胞內(nèi)復制;進一步采用RSV poly(A)捕獲法［9］檢測白藜蘆醇對RdRP轉(zhuǎn)錄活性的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠抑制RNP體外轉(zhuǎn)錄mRNA，即能夠抑制RSV的RdRP轉(zhuǎn)錄活性。

RSV的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性被抑制理論上意味著RSV核酸在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄被抑制，F(xiàn)蛋白表達量應顯著降低，其介導的細胞融合亦應被抑制，但是本實驗研究結(jié)果與理論不符。本實驗采用IF結(jié)合LSCM檢測表明白藜蘆醇對RSV的F蛋白表達量及其介導的細胞融合抑制作用不明顯。分析原因可能如下:本實驗采用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)檢測RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄活性，與實際細胞內(nèi) (包括動物體內(nèi))轉(zhuǎn)錄有差別;體內(nèi) (細胞內(nèi))轉(zhuǎn)錄過程及轉(zhuǎn)錄后翻譯可能存在負反饋調(diào)節(jié)機制，致使RSV在細胞內(nèi)的實際轉(zhuǎn)錄結(jié)果未表現(xiàn)出被抑制。白藜蘆醇抑制RSV感染的Hep-2病變效應可能通過其他途徑實現(xiàn)的。

近年來，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)RSV感染涉及到由多種細胞和細胞因子參與的固有免疫應答和適應性免疫應答，其中Toll樣受體 (TLR)，特別是TLR4、TLR3、TLR7等受體及其銜接蛋白MyD88與RSV感染關系密切［13-14］。白藜蘆醇是否通過TLRs介導的信號通路調(diào)節(jié)機體免疫功能發(fā)揮抗RSV效應，本課題組正進行相關研究。初步研究結(jié)果表明白藜蘆醇能夠調(diào)控RSV感染初期TLR3介導的信號通路及下游相關炎癥細胞因子的表達。

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