王 萍， 付 玲， 聶繼紅*， 卜淑衛(wèi)

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830000;2．新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊830054)

參浮化痰丸處方來源于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院長期臨床實踐的經(jīng)驗方，由黨參、浮小麥、陳皮、防風(fēng)、黃芩、制半夏等多味藥材組成，其主要功效為益氣固表，健脾燥濕，止咳化痰。用于慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期的治療，臨床療效較好。為方便患者使用，本課題將其研究開發(fā)成濃縮丸劑。在完成制備工藝的基礎(chǔ)上，為有效控制該制劑質(zhì)量，保證臨床療效，本研究對其進行了薄層色譜鑒別研究，建立了其中陳皮、防風(fēng)、黃芩的定性鑒別方法;采用高效液相色譜法，對制劑中的主要有效成分—橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷及升麻素苷進行定量分析，建立了參浮化痰丸的質(zhì)量標準，為全面有效控制產(chǎn)品質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀 (Waters 2996二極管陣列檢測器，美國 Waters公司);AL204電子天平 ［梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司］;AG135電子天平 ［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］;Direct-QTM超純水儀 (Millipore)。

1.2 試藥

對照品:陳皮對照藥材 (批號:120969-200808，供TLC法鑒別用);防風(fēng)對照藥材 (批號:120947-201108，供TLC法鑒別用);黃芩對照藥材 (批號:120955-201008，供TLC法鑒別用);橙皮苷對照品 (批號:110721-201014，供定量測定用);5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品 (批號:111523-201007，供定量測定用);升麻素苷對照品(批號:111522-201008，供定量測定用)均由中國藥品生物制品檢定所提供。

參浮化痰丸 (批號分別為20110712、20110713、20110714，由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院提供)。

水為超純水;乙腈、甲醇為色譜純試劑;薄層層析用硅膠G(青島海洋化工有限公司);實驗中所用其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 陳皮的薄層色譜鑒別［1-5］取本品適量，研細，取樣品粉末3 g，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過后，濾液蒸干，殘渣加水30 mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液;再用乙酸乙酯振搖提取4次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取橙皮苷對照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對照品溶液。另取陳皮對照藥材，同法制得對照藥材溶液。按處方比例稱取缺陳皮的其他藥材，按制備工藝制備陰性樣品，照上述方法制得缺陳皮的陰性對照溶液。照《中國藥典》2010年版一部附錄VI B薄層色譜法項下試驗，吸取供試品溶液5μL，對照品溶液2μL，對照藥材溶液及陰性對照溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水 (100∶17∶13)作為展開劑，展開至約6 cm時，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水 (20∶10∶1∶1)的上層溶液為展開劑，展開至約10 cm，取出后晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，晾干后置紫外光燈 (365 nm)下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。而陰性無干擾。見圖1。

圖1 陳皮薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of Citri reticulatae Pericarpium

2.2 防風(fēng)的薄層色譜鑒別［1，6-8］取本品粉末3 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min后，濾過，濾液蒸干后，加水20 mL，振搖使殘渣溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液后再用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干后，加甲醇1 mL使殘渣溶解，得到供試品溶液。另取5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。另取防風(fēng)對照藥材，同上述方法，制成對照藥材溶液。按處方比例稱取缺防風(fēng)的其他藥材，按制備工藝制備陰性樣品，同法制備缺防風(fēng)的陰性對照溶液。按《中國藥典》2010年版一部附錄VI B項下，分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液及陰性對照溶液各10μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇 (4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干后置紫外燈 (365 nm)下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾。見圖2。

圖2 防風(fēng)薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of Saposhnikoviae Radix

2.3 黃芩的薄層色譜鑒別［1，9-10］取本品 15 g，研細，加甲醇40 mL，加熱回流1 h后，濾過，濾液蒸干后，加水15 mL使殘渣溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至2后，再用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干后的殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液;另取黃芩對照藥材，照上述方法制備得到對照藥材溶液;另取黃芩苷對照品，加乙醇制得每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液;按處方比例稱取缺黃芩的其余藥材，按已得到的制備工藝制備陰性樣品，照上述方法制成缺黃芩的陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI B)，吸取供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，展開后取出，晾干。結(jié)果在供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性對照無干擾。結(jié)果見圖3。

2.4 橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的HPLC法測定［11-12］

2.4.1 色譜條件 SYMMETRY C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm，5μm)，流動相為乙腈－0.1%磷酸(17∶83)，橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的檢測波長分別為283 nm和254 nm，柱溫為30℃，體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10μL。

2.4.2 橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品37.50 mg，5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品24.78 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇使溶解后，稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液 (其中橙皮苷質(zhì)量濃度為0.750 0 mg/mL，5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度為0.495 6 mg/mL)。

圖3 黃芩薄層色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Scutellariae Radix

2.4.3 供試品溶液的制備 將樣品研細，精密稱取約1 g，置于錐形瓶中，加入甲醇10 mL，密塞，振搖，稱質(zhì)量，加熱回流1 h，冷卻后稱質(zhì)量并補足減失的質(zhì)量，濾過后，濾液再用0.45μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，進樣量10μL，經(jīng)高效液相色譜法測定，峰面積積分值經(jīng)2.4.6項下線性回歸方程計算得出醇提液中橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度，進一步計算得出樣品中橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的質(zhì)量濃度，即可。

2.4.4 陰性對照樣品溶液的制備 按處方比例精密稱取缺陳皮、防風(fēng)的其余藥材，按上述制備工藝制備得到陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照樣品溶液。

2.4.5 專屬性試驗 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，得到的色譜圖見圖4。結(jié)果表明:在供試品色譜中，呈現(xiàn)與對照品色譜主峰保留時間一致的色譜峰，且陰性對照色譜圖中在待測成分保留時間處無雜質(zhì)峰出現(xiàn)。表明本方法有良好的專屬性。

圖4 橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram s of hesperidin and 4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamm inol

2.4.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.4.2項下橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品貯備液各1、2、3、4 mL，置5 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻后，濾過，分別制成質(zhì)量濃度為150.0、300.0、450.0、600.0μg/mL的系列橙皮苷標準溶液及質(zhì)量濃度為 99.1、198.2、297.4、396.5 μg/mL的5-O-甲基維斯阿米醇苷標準系列溶液。用上述4個標準溶液及貯備液，按上述色譜條件分別進樣分析，進樣量為10μL。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，得到橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的回歸方程分別為:橙皮苷A=17 823.12 C－114 545.55(相關(guān)系數(shù) r=0.999 9);5-O-甲基維斯阿米醇苷A=24 227.05 C－4 589.67，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明:在150.0～750.0μg/mL范圍內(nèi)，橙皮苷峰面積值(A)與質(zhì)量濃度 (C)有良好的線性關(guān)系;而5-O-甲基維斯阿米醇苷在99.1～495.6μg/mL范圍內(nèi)，峰面積值 (A)與質(zhì)量濃度 (C)的線性關(guān)系良好。

2.4.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，結(jié)果橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的 RSD分別為0.38%(n=6)、0.66%(n=6)。表明儀器精密度良好。

取同一對照品溶液，連續(xù)測定5 d，測定峰面積值，結(jié)果橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的日間精密度 RSD分別為0.80% (n=6)、1.12%(n=6)。

2.4.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、6、12、24、48 h進樣，結(jié)果橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.70%(n=6)、1.75%(n=6)。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.9 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品，照供試品溶液制備方法平行制得6份供試品溶液，分別測定橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的量，結(jié)果其RSD分別為0.76%(n=6)、1.82%(n=6)，表明本試驗方法重復(fù)性良好。

2.4.10 加樣回收率試驗 精密稱取已測定的同批樣品6份，分別精密加入橙皮苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，按上述供試品溶液制備方法制備，按照確定的色譜條件測定，分別計算回收率，結(jié)果見表1、2。

表1 橙皮苷加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests of hesperidin(n=6)

表2 5-O-甲基維斯阿米醇苷加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests of 4'-O-β'-D-glucosyl-5-O-methylvisam m inol(n=6)

2.5 升麻素苷的 HPLC 法測定［1，13］

2.5.1 色譜條件 SYMMETRY C18色譜柱 (4.6 mm×150 mm，5μm)，流動相為甲醇-水 (33∶67)，檢測波長254 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量10μL。

2.5.2 對照品溶液的制備 精密稱取升麻素苷對照品3.86 mg，置100 mL量瓶中，加適量甲醇使溶解后，加甲醇至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為0.038 6 mg/mL升麻素苷貯備液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取樣品適量，研細，從中精密稱取樣品粉末約1 g，加甲醇20 mL，密塞，振搖后稱定質(zhì)量，超聲40 min，冷卻，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，濾液用0.45 μm的微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液，進樣量10μL，經(jīng)高效液相色譜法測定，峰面積積分值經(jīng)2.5.6項下線性回歸方程計算得出醇提液中升麻素苷的質(zhì)量濃度，進一步計算得出樣品中升麻素苷的量，即可。

2.5.4 陰性對照樣品溶液的制備 按處方比例精密稱取缺防風(fēng)的其余藥材后，按制備工藝制備，得到陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制得陰性對照樣品溶液。

2.5.5 專屬性試驗 分別精密吸取上述供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明:供試品色譜中呈現(xiàn)與對照品色譜主峰保留時間一致的色譜峰，而且在陰性對照色譜圖中，在與待測成分相同的保留時間處，無雜質(zhì)峰出現(xiàn)。表明本方法專屬性良好。

2.5.6 線性關(guān)系考察 精密吸取升麻素苷對照品貯備液各1、2、3、4 mL，置5 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，得到質(zhì)量濃度為7.72、15.44、23.16、30.88μg/mL的升麻素苷標準系列溶液。按上述色譜條件，用上述4個標準溶液及貯備液，分別進樣分析，進樣量為10μL。以峰面積積分值為縱坐標，對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標，得到升麻素苷的回歸方程為A=23 100.74 C+4 387.08，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。表明在7.7～38.6 μg/mL范圍內(nèi)，升麻素苷峰面積值 (A)與質(zhì)量濃度 (C)呈良好的線性關(guān)系。

圖5 升麻素苷高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram s of prim-O-glucosylcim ifugin

2.5.7 精密度試驗 精密吸取升麻素苷對照品溶液10μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積值，結(jié)果其RSD為0.40%，表明儀器有良好的精密度。

取同一對照品溶液，連續(xù)測定5 d，結(jié)果其峰面積的日間精密度RSD為0.47%。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、6、12、24、48 h分別進樣分析，結(jié)果其峰面積的RSD為1.59%。結(jié)果表明，在48 h內(nèi)供試品溶液有良好的穩(wěn)定性。

2.5.9 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品，照供試品溶液制備方法，平行制得6份供試品溶液后，分別測定升麻素苷的量，計算，結(jié)果其 RSD為1.52%，表明本方法有良好的重復(fù)性。

2.5.10 加樣回收率試驗 取已測定的同批樣品，精密稱取6份，按照表3精密加入升麻素苷對照品適量，照供試品溶液制備方法制備，得到測試溶液，按確定的色譜條件進樣分析，計算，得到其回收率見表3。

表3 升麻素苷加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)Tab.3 Results of recovery tests of prim-O-glucosyl-cim ifuqin(n=6)

2.6 樣品測定結(jié)果 取不同批號的樣品，按前述供試品溶液制備法制備，按照確定的色譜條件測定，計算結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果 (n=3)Tab.4 Determination results(n=3)

3 討論

在參考2010年版《中國藥典》 (一部)及大量文獻的基礎(chǔ)上，本試驗對全方藥味分別進行了TLC法定性鑒別試驗研究，分別采用多種不同的供試品處理方法及展開劑進行試驗，結(jié)果參浮化痰丸中主要成分陳皮、黃芩、防風(fēng)薄層色譜斑點清晰，分離效果較好，具有重現(xiàn)性好、專屬性強、簡便、快速等特點，可作為該制劑的定性鑒別依據(jù)。而方中其余藥材如黨參、浮小麥、制半夏等，因未能得到理想的TLC圖譜，因此未能列入質(zhì)量標準。

在陳皮的薄層色譜鑒別研究中，曾參照2010年版《中國藥典》 (一部)［1］及文獻［2-5］項下方法，采用石油醚回流提取或甲醇超聲處理等多種供試品處理方法，并以三氯甲烷-甲醇-水(32∶17∶5)的下層溶液或乙酸乙酯-甲醇-水 (6∶1∶3)的上層溶液等為展開劑，結(jié)果均未得到理想的色譜圖;后又多次進行展開劑距離的調(diào)整，結(jié)果得到了比較理想的薄層色譜圖。因此將其列入了質(zhì)量標準。

在采用HPLC法測定橙皮苷時，曾分別采用了甲醇-醋酸-水 (35 ∶4 ∶61)［1］、乙腈-水-冰醋酸(22 ∶77 ∶1)［2］、乙腈-0.15% 醋酸 (20 ∶80)［3］、甲醇-冰醋酸溶液 (37∶63)［4］多種流動相進行研究，均未能得到理想的色譜圖，而當(dāng)采用乙腈-0.1%磷酸 (17∶83)作為流動相時，得到的色譜圖峰形較好，分離度較理想。

在研究過程中曾試圖采用甲醇-水(40∶60)［1］、甲醇-水 (38∶62)［13］等流動相，對升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷同時進行測定，但由于升麻素苷出峰時間較晚，因此在本研究中無法采用同一流動相同時測定5-O-甲基維斯阿米醇苷和升麻素苷。而當(dāng)采用乙腈-0.1%磷酸 (17∶83)作為流動相時，得到的5-O-甲基維斯阿米醇苷峰形較好，分離度較理想。因此意外發(fā)現(xiàn)5-O-甲基維斯阿米醇苷和橙皮苷可以采用同一流動相在不同波長處同時測定，而且經(jīng)方法學(xué)考察各項指標均符合定量測定的要求。

在采用HPLC法測定升麻素苷時，分別采用了甲醇-水 (40 ∶60)［1］、甲醇 －0.04 mol/L 乙酸鈉(30 ∶70)［6］、甲醇-水 (38 ∶62)［13］、乙腈-水-醋酸 (13∶88∶0.03)［14］作為流動相進行分離，結(jié)果得到的升麻素苷峰均未能與雜質(zhì)峰有效分離。因此考慮調(diào)整流動相的比例，在結(jié)合峰形、分離度及出峰時間等多種因素的情況下，最終在流動相為甲醇-水 (33∶67)時，升麻素苷峰與雜質(zhì)峰有效分離。經(jīng)方法學(xué)考察各項指標均符合定量測定的要求。

橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷定量測定項下，在供試品溶液的制備過程中，為了保證樣品中橙皮苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷充分提取，分別對不同種類的提取溶劑 (乙醇、甲醇)、不同質(zhì)量分數(shù)的提取溶劑 (50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇)、溶劑加入倍量 (5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)、提取方法 (不同超聲處理時間、不同回流時間)進行考察。結(jié)果本品用10倍量甲醇，回流提取1 h，提取效果較好。

在研究供試品溶液的提取方法時，為了使樣品中升麻素苷充分提取，分別對乙醇、甲醇作為提取溶劑、不同質(zhì)量分數(shù)的甲醇提取溶劑 (50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇)、甲醇不同加入量 (10倍、20倍、30倍、40倍、50倍)、樣品提取方法 (不同超聲處理時間、不同回流時間)進行了研究，結(jié)果表明，本品用20倍量甲醇超聲40 min處理時，升麻素苷提取效果較好。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010．

［2］林以寧，趙浩如，楊曉琴．健脾藥糕的質(zhì)量標準研究［J］．中國藥房，2005，16(1):57-58．

［3］鄭志宏，蘇彥斌，張鳳榮．安神溫膽丸質(zhì)量標準的研究［J］．中成藥，2009，31(8):1219-1223．

［4］金 陽．健脾顆粒質(zhì)量標準研究［J］．中成藥，2007，29(9):1403-1405．

［5］孫冬梅．二陳湯復(fù)方顆粒質(zhì)量標準的研究［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2007，13(10):9-10．

［6］黃杰芳，李惠霞，鄧慧敏．辛夷鼻炎丸的質(zhì)量標準研究［J］．中草藥，2009，40(8):1245-1247．

［7］徐韌柳，葛智鑫．感冒清熱顆粒質(zhì)量標準研究［J］．中成藥，2006，28(5):664-668．

［8］肖永慶，楊 濱，姚三桃，等．防風(fēng)質(zhì)量標準的研究［J］．中國中藥雜志，2001，26(3):185-187．

［9］劉征輝，葉挺祥，趙洪芝，等．黃連羊肝片質(zhì)量標準研究［J］．中成藥，2009，31(8):附3-附6．

［10］龔蘇曉，張鐵軍，許 浚，等．兒童清肺糖漿質(zhì)量標準研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2008，19(2):467－469．

［11］林 清，吳雪梅，馬曉鸝，等．HPLC法測定健脾顆粒中橙皮苷的含量［J］．中國藥房，2009，20(9):698-699．

［12］陸靜嫻，祝 明，陳 勇．HPLC同時測定藿香清胃顆粒中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、梔子苷含量［J］．中成藥，2009，31(11):1701-1704．

［13］毛彥杰，岳 敏，谷學(xué)新，等．五虎散質(zhì)量標準的研究［J］．中草藥，2004，35(12):1354-1356．

［14］劉煥蓉，王 虹，秦雪梅，等．HPLC法測定玉屏風(fēng)不同配伍中 4種黃酮成分［J］．中草藥，2011，42(6):1122-1124．