盧莉娜， 趙偉春， 沈嬋娟， 郭 偉

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053)

湖州鐵線蓮Clematis huchouensis Tomura，藥名金剪刀，為雙子葉植物藥毛茛科植物湖州鐵線蓮的全草［1］，辛、咸、溫，入肝、膀胱經(jīng)［2］，別名河邊威靈仙、吳興鐵線蓮(《杭州藥用植物名錄》)。鐵線蓮屬植物作為藥用已有很長(zhǎng)歷史，我國(guó)中醫(yī)臨床和民間常用于利尿通淋、祛風(fēng)止痛。自20世紀(jì)70年代開(kāi)始，已開(kāi)展對(duì)鐵線蓮及其同屬近緣植物的化學(xué)成分研究，迄今為止，從中分離出三萜皂苷、木脂素、黃酮、香豆素、生物堿、酚性成分和糖酯等多種成分［3］。三萜皂苷類成分為齊墩果酸或常春藤皂苷元的衍生物，因其所結(jié)合的糖數(shù)目及種類不同而異，是鐵線蓮的主要化學(xué)成分，且含量豐富［4］，生物活性多樣，幾乎無(wú)毒副作用，在臨床上具有廣泛用途和良好療效?，F(xiàn)代研究表明具有明顯的抗炎、護(hù)肝、抗腫瘤以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。國(guó)內(nèi)、外學(xué)者對(duì)該屬植物的藥理作用進(jìn)行了較多的實(shí)驗(yàn)研究，一些品種已經(jīng)做成制劑用于臨床治療。

大孔吸附樹(shù)脂在上世紀(jì)70年代末開(kāi)始應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離，1979年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所植化室報(bào)道大孔樹(shù)脂［5］可用于三棵針生物堿、赤芍苷、天麻苷、薄蓋靈芝中尿嘧啶與尿嘧啶核苷的分離。它對(duì)糖類的吸附能力很差，對(duì)色素的吸附能力較強(qiáng)，對(duì)皂苷、黃酮亦有很強(qiáng)的吸附作用［6］。利用大孔吸附樹(shù)脂的多孔結(jié)構(gòu)和選擇性吸附功能可從中藥提取液中分離精制有效成分或有效部位，最大限度地去粗取精。根據(jù)桂雙英等［7］、吳方暉等［8］研究發(fā)現(xiàn)，D101和 AB-8樹(shù)脂是在分離皂苷類物質(zhì)中使用率較高、效果較好的兩種樹(shù)脂。通過(guò)比較不同樣品上樣量下D101和AB-8兩種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)總皂苷的吸附率和解析率，能夠找出分離能力更好的樹(shù)脂，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用和新藥開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 原料

湖州鐵線蓮于2008年7月初采自浙江湖州，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姚振生教授鑒定為中藥湖州鐵線蓮 (吳興鐵線蓮);D101大孔吸附樹(shù)脂(天津農(nóng)藥股份有限公司)、AB-8大孔吸附樹(shù)脂(天津市海光化工有限公司);齊墩果酸 (中國(guó)藥品生物制品鑒定所)。

1.2 試劑

95%工業(yè)酒精;石油醚、冰醋酸、高氯酸、香草醛為分析純。

1.3 儀器

TU1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海生申科技有限公司);FZ102微型植物試樣粉碎機(jī) (天津市泰斯利儀器有限公司);恒溫水浴鍋 (金壇市大地自動(dòng)化儀器廠);DZF—6050型真空干燥箱 (上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 湖州鐵線蓮的乙醇提取

新鮮的湖州鐵線蓮葉和莖，置于鼓風(fēng)干燥箱中56℃恒溫烘干至恒定質(zhì)量，粉碎，取100 g粉末于圓底燒瓶中，以1∶5(kg/L)的比例加入石油醚，70℃回流脫脂2次，每次1 h，過(guò)濾后將殘?jiān)L(fēng)干。向風(fēng)干后的殘?jiān)屑尤?倍量的80%乙醇，浸泡過(guò)夜，在85℃回流提取2次，每次1 h。用四層紗布過(guò)濾，合并3次回流所得藥液，濾液濃縮至無(wú)醇味，再放入真空干燥箱中干燥至恒定質(zhì)量，即得湖州鐵線蓮浸膏。稱取2.843 g浸膏，加入蒸餾水定容至500 mL，配制成5.686 g/L的湖州鐵線蓮乙醇提取物樣品溶液，備用。

2.2 湖州鐵線蓮總皂苷的測(cè)定

2.2.1 最大波長(zhǎng)的選擇 精密稱取10.00 mg齊墩果酸對(duì)照品，用甲醇溶解定容至10 mL量瓶。分別吸取0.0、20.0μL溶液于10 mL的具塞試管中，真空干燥隔夜蒸干溶劑。分別加入0.2 mL 5%香草醛－冰醋酸 (新鮮配制)和0.8 mL高氯酸進(jìn)行顯色，70℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻3 min，然后加入5 mL冰醋酸稀釋，以空白溶液為參比溶液，搖勻后全波長(zhǎng)掃描，得出齊墩果酸對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)。

2.2.2 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確量取0.0、20、40、60、80、100μL對(duì)照品溶液，蒸干溶劑后顯色方法如上所述，以空白溶液為參比溶液，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 湖州鐵線蓮總皂苷的測(cè)定方法 取湖州鐵線蓮乙醇提取物樣品溶液1 mL和0 mL于10 mL具塞試管中，其中0 mL為空白溶液。根據(jù)2.2.1項(xiàng)的方法，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算湖州鐵線蓮樣品的皂苷的量。

2.3 D101和AB-8樹(shù)脂對(duì)湖州鐵線蓮總皂苷吸附能力的比較研究

2.3.1 上樣量對(duì)總皂苷吸附率的影響 1)吸附:取D101和AB-8樹(shù)脂各5份，每份折合成干樹(shù)脂1.0 g(其中1.9 g D101濕樹(shù)脂烘干后為1.0 g D101干樹(shù)脂;3.0 g AB-8濕樹(shù)脂烘干后為1.0 g AB-8干樹(shù)脂)于錐形瓶，加入湖州鐵線蓮乙醇提取物樣品溶液各5、10、15、20、25 mL于10個(gè)錐形瓶中，密封瓶口，并置于搖床上120 r/min震蕩，靜止吸附20 h。用移液槍吸取經(jīng)樹(shù)脂吸附后的溶液用于測(cè)定皂苷的濃度。樹(shù)脂用去離子水沖洗至無(wú)色后進(jìn)行真空抽濾，備用。

2)吸附后溶液皂苷的測(cè)定:取一定體積的上述經(jīng)樹(shù)脂吸附后的溶液于10 mL的具塞試管中，其中0 mL為空白溶液。根據(jù)2.2.1項(xiàng)的方法，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算湖州鐵線蓮樣品的皂苷的量。

2.3.2 上樣量和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷解析率的影響 采用兩種方法對(duì)經(jīng)靜態(tài)吸附了湖州鐵線蓮乙醇提取物的D101和AB-8樹(shù)脂進(jìn)行解析。1)分步洗脫:取上述經(jīng)靜態(tài)吸附了湖州鐵線蓮乙醇提取物的D101和AB-8樹(shù)脂各5份。分步加入體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%的乙醇溶液，用量依次對(duì)應(yīng)為 5、10、15、20、25 mL，120 r/min震蕩解析20 h。

2)一次性洗脫:取上述經(jīng)靜態(tài)吸附的D101和AB-8樹(shù)脂各5份，去掉上層溶液。一次性加入50%，70%，95%的乙醇溶液，乙醇溶液的用量依次對(duì)應(yīng)為5、10、15、20、25 mL，120 r/min震蕩解析20 h。

2.3.3 上樣量和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷提取率的影響 計(jì)算并比較D101和AB-8樹(shù)脂對(duì)皂苷提取率。

3 結(jié)果與分析

3.1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)紫外分光光度計(jì)掃描，可見(jiàn)齊墩果酸在548 nm處有最大吸收峰。經(jīng)擬合，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02～0.100 mg范圍內(nèi)，吸光度與齊墩果酸質(zhì)量呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=0.114 5X+0.006 8，R=0.999 4。式中Y為齊墩果酸質(zhì)量，X為吸光度。

3.2 上樣量對(duì)總皂苷吸附能力的影響

3.2.1 不同上樣量下D101和AB-8樹(shù)脂對(duì)總皂苷吸附能力的比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、2。D101樹(shù)脂和AB-8樹(shù)脂對(duì)湖州鐵線蓮皂苷的吸附量隨著上樣量的增加而增加，而吸附率則隨著上樣量的增加而減少。AB-8樹(shù)脂在不同上樣量下對(duì)皂苷的吸附量都較D101樹(shù)脂大，吸附效果較好。

圖1 不同上樣量下D101和AB-8樹(shù)脂對(duì)皂苷吸附量的比較Fig.1 Comparison on the adsorption quantity of D101 and AB-8 resin on saponins in different sample volumes

圖2 不同上樣量下D101和AB-8樹(shù)脂對(duì)皂苷吸附率的比較Fig.2 Comparison on the adsorption rate of D101 and AB-8 resin on saponins in different sam p le volumes

3.2.2 不同上樣量下D101和AB-8樹(shù)脂對(duì)乙醇分步洗脫總皂苷解析率的比較 在用低體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫的情況下，D101和AB-8樹(shù)脂對(duì)皂苷的解析能力差別不大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，AB-8樹(shù)脂的解析能力明顯優(yōu)于D101樹(shù)脂 (如圖3、圖4和圖5)。因此在一次性洗脫時(shí)僅選用AB-8樹(shù)脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 D101和AB-8樹(shù)脂30%乙醇洗脫解析率的比較Fig.3 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 30%ethanol

圖5 D101和AB-8樹(shù)脂50%乙醇洗脫解析率的比較Fig.5 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 50%ethanol

圖6 D101和AB-8樹(shù)脂70%乙醇洗脫解析率的比較Fig.6 Comparison on the resolution rate of D101 and AB-8 resin on saponins eluted with 70%ethanol

3.2.3 不同上樣量下AB-8樹(shù)脂對(duì)乙醇一次洗脫總皂苷解析率和提取率的比較 由圖6、7可知，隨著單位質(zhì)量的樹(shù)脂處理的樣品量增大，相同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)總皂苷的解析率和提取率均不斷增大，當(dāng)樹(shù)脂的上樣量比為1∶20時(shí)，解析率和提取率均達(dá)最大值。當(dāng)樹(shù)脂的上樣量一定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，皂苷的解析率和提取率亦逐漸增大。由于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)一些吸附在樹(shù)脂上的非極性成分很容易被洗脫下來(lái)，會(huì)降低皂苷的純度，同時(shí)考慮到乙醇用量和后續(xù)工藝中濃縮的工作量，因此，篩選出皂苷靜態(tài)吸附最佳提取條件為樹(shù)脂的上樣量比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%。

圖6 AB-8樹(shù)脂靜態(tài)吸附乙醇一次性洗脫解析率比較Fig.6 Comparison on the resolution rate of saponins statically adsorbed by AB-8 resin and disposable eluted with ethanol

圖7 AB-8樹(shù)脂靜態(tài)吸附乙醇一次性洗脫提取率比較Fig.7 Comparison on the extraction rate of saponins statically adsorbed by AB-8 resin and disposab le eluted with ethanol

4 討論

4.1 植物的乙醇提取物中含有皂苷、黃酮和色素等多種成分。目前，對(duì)鐵線蓮屬植物皂苷類成分的研究報(bào)道比較多，其次為黃酮類成分［3］，木脂素類等成分的研究報(bào)道較少［9］。鐵線蓮屬植物中威靈仙含原白頭翁素及以常春藤皂苷元、表常春藤皂苷元和齊墩果酸為苷元的皂苷［10］。但湖州鐵線蓮屬植物中皂苷的提取分離及其組成尚未見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)外有關(guān)對(duì)湖州鐵線蓮中黃酮類化合物提取分離純化工藝及生理活性的報(bào)道也不多。僅見(jiàn)浙江大學(xué)藥學(xué)院利用高效液相色譜法比較了分別采自杭州和浙江湖州鐵線蓮8個(gè)組分的含有量差異［11］。

4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D101樹(shù)脂和AB-8樹(shù)脂對(duì)皂苷均有極好的吸附能力，兩者的解析率亦隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而提高，其中AB-8樹(shù)脂對(duì)湖州鐵線蓮乙醇提取物中皂苷的吸附能力和乙醇的解析能力均優(yōu)于D101樹(shù)脂。其原因可能是因?yàn)榇罂孜綐?shù)脂是通過(guò)物理吸附從水溶液中有選擇地吸附有機(jī)物，而AB-8樹(shù)脂顆粒較細(xì)小，因而具有更大的比表面積，等量的樹(shù)脂擁有更大的吸附量。因此，篩選了AB-8樹(shù)脂對(duì)湖州鐵線蓮乙醇提取物進(jìn)行吸附和解析，去除了湖州鐵線蓮乙醇提取物中不易被大孔樹(shù)脂吸附的其它成分。但是，AB-8樹(shù)脂對(duì)湖州鐵線蓮黃酮亦具有較好的吸附能力，如何將湖州鐵線蓮乙醇提取物中的皂苷進(jìn)一步分離純化出來(lái)還有待于進(jìn)一步研究。

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