馬瑞麗， 張 蓉， 徐秀泉， 湯 建， 汪占弟， 歐陽臻*

(1．江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2．蘭州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州730050)

大血藤為大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.et Wils.的藤莖，別名紅藤、紅皮藤、大活血等，主產(chǎn)于安徽、浙江、江西、湖北、廣西等地。具有清熱解毒、理氣活血、祛風(fēng)殺蟲、消腫散結(jié)、止痛、通經(jīng)、敗毒等功效［1］。近年來藥理活性研究表明大血藤具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌以及抗炎免疫活性，臨床用以治療闌尾炎、月經(jīng)不調(diào)、崩漏、腸癰腹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、風(fēng)濕痹痛、跌打腫痛等。化學(xué)研究表明大血藤含有大量酚酸類物質(zhì)［2-5］，推測其為主要藥效活性成分之一。而酚酸類物質(zhì)作為一類具有獨(dú)特生理和藥理活性的天然產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，在抑菌、抗腫瘤、防衰老和抗炎免疫等方面都具有良好的功效［6-7］。Li等［8］研究了45種植物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)大血藤甲醇提取物具有較高的抗氧化活性，并且總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.35 mg/g，高于其它44種植物。大血藤有降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠異常升高的TNF-α，IL-6水平，減輕局部炎癥的作用，可能與富含的多酚類成分有關(guān)［9-10］。但目前對大血藤總酚提取工藝的研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首次研究了采用超聲提取法提取大血藤中總酚的提取工藝，應(yīng)用響應(yīng)面法 (response surface methodology，RSM)對超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為大血藤中總酚酸的進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KQ—250 DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，UV—2550型紫外-可見分光光度計(jì) (日本島津公司)，BS—110S型電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DHG—9145型鼓風(fēng)干燥箱 (上海一恒科技有限公司)，HH—S2數(shù)字恒溫水浴鍋 (金壇市醫(yī)療儀器廠)，高速中藥粉碎機(jī) (瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)，S-2藥典檢驗(yàn)篩 (浙江上虞市華康化驗(yàn)儀器廠)。

1.2 試藥 大血藤藥材購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)鑒定為大血藤科植物大血藤Sargentodoxa cuneata Rehd．的藤莖。沒食子酸對照品 (批號(hào):110831-200803)購自中國藥品生物制品檢定所，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑自制，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總酚的測定 總酚測定參照文獻(xiàn)［11］，采用Folin-Ciocalteu法測定，略有改進(jìn)，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.1 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，置于100 mL量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，即得50μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取沒食子酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，分別加入6 mL蒸餾水，混勻，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混勻，0.5～8 min內(nèi)加入1.5 mL 20%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10 mL，混勻。75℃水浴10 min，以空白試劑調(diào)零，在760 nm波長下測定吸光度。每個(gè)濃度做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光值為縱坐標(biāo)，總酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為:Y=0.117 4X+0.013 9，r=0.999 6。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在1～7μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取過《中國藥典》2號(hào)篩的干燥大血藤粉末適量，每份1 g，超聲提取之前加適量溶劑浸泡1 h，按單因素條件及表2中Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)超聲提取 (通過加少量冷水控制溫度)。精密吸取各提取液的上清液300μL，蒸餾水定容至25 mL，搖勻，過濾即得。

2.1.4 供試品總酚量測定及總酚得率計(jì)算 精密吸取上述供試品溶液1 m L，按2.1.2項(xiàng)下操作方法測定吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)3次，并根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液質(zhì)量濃度，計(jì)算總酚得率。

2.2 提取工藝篩選

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)考察了含乙醇量 (40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，n=3)、提取溫度 (30、40、50、60、70℃，n=3)、料液比 (1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，n=3)、超聲時(shí)間 (0、20、30、40、50、60 min，n=3)、提取次數(shù) (1次、2次、3次，n=3)對大血藤總酚得率的影響。每次稱取1 g大血藤粉末進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取所得提取液的上清液稀釋后按2.1.2項(xiàng)下測定吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液中總酚得率，結(jié)果見圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明:含乙醇量、提取溫度和提取時(shí)間對提取效果的影響較大;隨著料液比的增大，總酚得率在1∶10～1∶20緩慢增加，在料液比為1∶25時(shí)有最大值，之后隨料液比的增加，總酚得率反而降低;并且超聲提取一次總酚得率為9.85%，提取兩次總酚得率為10.15%，即提取一次幾乎可以將總酚類物質(zhì)完全提取。從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1∶25，超聲提取一次即可。

2.2.2 響應(yīng)面分析因素水平及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的初步結(jié)果，采用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以含乙醇量 (A)、提取溫度 (B)和提取時(shí)間 (C)3個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素取3個(gè)水平，分別以-1、0、1編碼，以總酚得率為響應(yīng)值，含乙醇量60%、提取溫度60℃、提取時(shí)間30 min為中心點(diǎn)施行響應(yīng)面分析，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素水平

2.2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果 使用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.05b對表2中總酚得率數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總酚得率對編碼自變量A、B和C的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=10.59－0.34A+0.020B+0.51C－0.46AB+0.25AC－0.053BC－0.47A2－0.48B2－0.61C2。方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3，回歸方程可信度分析見表4。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由方差分析可知，此模型極顯著 (P＜0.001)，模型決定系數(shù)R2=0.962 4及失擬項(xiàng)不顯著 (P＞0.5)，說明方程擬合度和可信度均良好，試驗(yàn)誤差小，故此模型可用于大血藤總酚提取工藝研究的分析和預(yù)測。

表3 方差分析結(jié)果

表4 回歸方程可信度分析

由表3可以看出，各因素中一次項(xiàng)C是極顯著的，其次是二次項(xiàng)C2;A、AB、AC、A2、B2均影響顯著，表明各影響因素對總酚得率的影響不是簡單的線性關(guān)系。一次項(xiàng)B和交互項(xiàng)BC影響不顯著，表明提取溫度和提取溫度與提取時(shí)間的交互作用對總酚得率的影響不顯著。響應(yīng)面分析立體圖見圖2～4。

圖2 含乙醇量和提取溫度對總酚得率的影響

圖3 含乙醇量和提取時(shí)間對總酚得率的影響

圖4 提取溫度和提取時(shí)間對總酚得率的影響

由圖可知，各因素對總酚得率影響的大小依次為提取時(shí)間、提取濃度和提取溫度，其中提取時(shí)間 (C)的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較為陡峭，而含乙醇量和提取溫度次之，表現(xiàn)為曲面較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

根據(jù)所得到的模型，可預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最大響應(yīng)值 (Y)為10.735%，對響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，以總酚得率為評價(jià)指標(biāo)，得到相應(yīng)的提取工藝優(yōu)化條件為:乙醇 (A)為56.49%，提取溫度 (B)為61.71℃，提取時(shí)間 (C)為33.43 min。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行大血藤總酚的提取試驗(yàn)，考慮到實(shí)際情況，將修正后的最佳提取條件定為乙醇 (A)為56%，提取溫度 (B)為62℃，提取時(shí)間 (C)為34 min，提取1次，共進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到大血藤總酚平均得率為10.629%(RSD為1.95%)，與理論預(yù)測值10.735%的相對誤差為－0.99%，與預(yù)測值接近，說明此模型可靠。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，首次對超聲提取法提取大血藤總酚的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了二次多項(xiàng)回歸模型。此模型極顯著，模型決定系數(shù)R2=0.962 4及失擬項(xiàng)不顯著，可用于大血藤總酚提取工藝研究的分析和預(yù)測。優(yōu)化后確定的大血藤總酚超聲提取的最佳工藝條件是含乙醇為56%，料液比為1∶25，在62℃下超聲提取時(shí)間34 min，提取一次即可。

酚類化合物是該藥材的主要活性成分之一，研究其總酚的提取工藝，為該藥材的進(jìn)一步開發(fā)提供重要參考。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化大血藤中總酚超聲提取工藝，該工藝大大縮短提取時(shí)間，提取充分，能耗低，操作方便，是較為理想的提取總酚的方法。

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