李朝霞，張秋霞，趙暉，汪平

（1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.北京東明共成醫(yī)藥科技有限公司，北京 100069）

乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保護(hù)作用

李朝霞1，張秋霞1，趙暉1，汪平2

（1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.北京東明共成醫(yī)藥科技有限公司，北京 100069）

摘 要：探討乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫失衡的保護(hù)作用。Balb/c小鼠隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，乳鐵蛋白組（5、25、50、500 mg/kg）。連續(xù)灌胃給藥27 d，第27天給藥后除正常對(duì)照組外，其他小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，繼續(xù)灌胃至第30天，末次給藥24 h后，放射免疫分析方法測(cè)定各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞。酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10的變化。與正常對(duì)照組相比，模型小鼠外周血CD4+T、CD8+T百分率明顯增加；血清 IFN-γ明顯降低（p<0.01），IL-4明顯增高（p<0.05），IFN-γ/IL-4比值明顯下降（p<0.01）；乳鐵蛋白25、50、500 mg小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分率明顯降低（P<0.01或P<0.05）。乳鐵蛋白500 mg組小鼠血清IFN-γ較模型組明顯增高（p<0.05），乳鐵蛋白50、500 mg小鼠血清IFN-γ/IL-4比值趨于正常。乳鐵蛋白能不同程度修復(fù)環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫失衡狀態(tài)，具有免疫保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：乳鐵蛋白；環(huán)磷酰胺；免疫功能

乳鐵蛋白是由中性粒細(xì)胞分泌，為非血紅素鐵結(jié)合性糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。對(duì)于其功能研究最早開始于其結(jié)合鐵的特性的研究。近年研究表明，乳鐵蛋白具有免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)鐵的傳遞和吸收、促進(jìn)腸道菌群的平衡、廣譜的抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等多種生物功能活性[1-2]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫損傷小鼠的T細(xì)胞亞群及Th1和Th2型細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10）的影響，為乳鐵蛋白的免疫活性研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Balb/c小鼠，雌雄兼用，6周～8周齡，體質(zhì)量18 g～22 g，由北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2006-0009。

1.1.2 藥物及試劑

乳鐵蛋白由日本NRL制藥股份有限公司提供；環(huán)磷酰胺為山東普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；小鼠CD4+T、CD8+T放免檢測(cè)試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供；小鼠細(xì)胞因子 IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10檢測(cè)試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.1.3 主要儀器

r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀：中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn)；Biofuge15R低溫離心機(jī)：Heraeussepatech（德國(guó)）；JA-1003電子分析天平：上海精科天平廠；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀：ThermoLabsystem公司（芬蘭）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理

67只小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照1組10只、正常對(duì)照2組10只、乳鐵蛋白5 mg/kg11只、25 mg/kg 11只、50 mg/kg13只、500 mg/kg12只。各給藥組按不同劑量給乳鐵蛋白，灌胃容積為0.2mL/10 g小鼠。正常對(duì)照1組與正常對(duì)照2組灌胃給等容量的生理鹽水，每天給藥1次。連續(xù)給藥27 d，第27天給藥后除正常對(duì)照1組外，其他5組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，環(huán)磷酰胺注射后繼續(xù)灌胃至第30天，末次給藥后次日，取材，檢測(cè)。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后，動(dòng)物禁食12 h，麻醉取血，分離血清，放射免疫分析方法測(cè)定各組大鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞。酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4，IL-10 的變化。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 13.0 for windows進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用描述，行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞的影響

乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞的比較（±s）Table 1 Comparison of CD4+T，CD8+T Cells in Peripheral Blood of Mice（±s）

表1 各組小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞的比較（±s）Table 1 Comparison of CD4+T，CD8+T Cells in Peripheral Blood of Mice（±s）

注：與模型組對(duì)比**P<0. 01；*P<0.05。

分組 只數(shù)濃度/（mg/kg） CD4+T/% CD8+T/% CD4+/CD8+/%空白對(duì)照組 9 36.04±3.53**29.69±2.26** 1.21±0.06模型組 10 46.76±4.34 39.27±5.62 1.20±0.10乳鐵蛋白 11 5 46.55±4.26 39.81±3.37 1.17±0.04乳鐵蛋白 12 25 37.24±5.68**31.91±5.26** 1.17±0.04乳鐵蛋白 11 50 40.12±4.73**33.34±3.47** 1.20±0.07乳鐵蛋白 13 500 42.38±4.56* 34.81±5.80* 1.23±0.13

從表1可以看出，與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T百分率均明顯增加；乳鐵蛋白25、50、500 mg可不同程度降低環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分率（P<0.01或P<0.05）。

2.2 乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠Th1/Th2類細(xì)胞因子的影響

乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠Th1/Th2類細(xì)胞因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清細(xì)胞因子變化（±s，n=10）Table 2 Changes of Serum Cytokines in Mice（±s，n=10）

表2 各組小鼠血清細(xì)胞因子變化（±s，n=10）Table 2 Changes of Serum Cytokines in Mice（±s，n=10）

注：**p<0. 01；*p<0.05與模型組相比。

分組濃度/（mg/kg）IFN-γ/（pg/mL）IL-2/（pg/mL）IL-4/（pg/mL）IL-10/（pg/mL）IFN-γ/IL-4正常組 133.31±30.14** 29.00±9.03* 42.32±6.40** 54.44±10.56 3.19±0.66**模型組 105.27±24.57 40.04±12.81 59.99±11.85 55.07±11.85 1.76±0.27乳鐵蛋白 5 120.53±17.53 29.31±5.11* 58.93±9.54 46.60±7.98 2.08±0.36乳鐵蛋白 25 109.73±15.01 36.20±5.90 60.29±8.71 47.42±12.85 1.84±0.29乳鐵蛋白 50 113.26±18.62 39.71±8.44 53.97±15.67 51.08±10.76 2.28±0.89*乳鐵蛋白 500 130.01±28.02* 35.39±14.10 55.95±6.45 55.67±16.97 2.36±0.62*

從表2可以看出，模型小鼠血清Th1類細(xì)胞因子IFN-γ 明顯降低（p＜0.01）；IL-2 明顯增高（p＜0.05）；乳鐵蛋白500 mg組小鼠血清IFN-γ較模型組明顯增高（p＜0.05）；乳鐵蛋白5 mg組小鼠血清IL-2明顯降低，較模型組差異顯著（p＜0.05）。

模型小鼠血清Th2類細(xì)胞因子不同程度增高，特別是IL-4較正常組差異顯著（p＜0.05）；乳鐵蛋白5、50、500 mg小鼠血清Th2類細(xì)胞因子IL-4、IL-10有降低趨勢(shì)，但與模型組比較，均無(wú)顯著性差異。

模型組小鼠血清IIFN-γ/IL-4比值較正常小鼠明顯降低（p＜0.01），與模型組相比，乳鐵蛋白 50、500 mg組小鼠血清IFN-γ/IL-4比值明顯增高（p＜0.05）。結(jié)果表明，乳鐵蛋白可使環(huán)磷酰胺致Th1/Th2平衡漂移有所改善。

3 討論

外周淋巴細(xì)胞亞群的穩(wěn)定是維持機(jī)體正常免疫調(diào)節(jié)功能所必需的，是評(píng)估機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。Balb/c小鼠為常用的近交系小鼠，其外周血淋巴細(xì)胞約占白細(xì)胞總數(shù)的60%～80%，這一特點(diǎn)有利于觀察乳鐵蛋白對(duì)環(huán)磷酰胺處理小鼠淋巴細(xì)胞的影響。CD4+T細(xì)胞為輔助性T細(xì)胞，可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，傳遞抗原信息，促進(jìn)T和B淋巴細(xì)胞增殖分化，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中主要起調(diào)節(jié)作用；CD8+T細(xì)胞為抑制性和殺傷性T細(xì)胞，有免疫抑制和細(xì)胞毒作用，可抑制CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞功能，通過(guò)自身及抑制因子在免疫反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用[3]。本研究表明，環(huán)磷酰胺處理小鼠外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞百分率均明顯增加，乳鐵蛋白25、50、500 mg可降低小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞百分率。結(jié)果提示乳鐵蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

輔助性T細(xì)胞（Th）在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，根據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同，Th細(xì)胞分為Th1與Th2兩種類型。Th1/Th2細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有重要的調(diào)節(jié)作用。感染性疾病，自身免疫病，過(guò)敏性疾病，移植排斥反應(yīng)中，均伴有Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)失衡。IFN-γ和IL-4可以分別代表Th1和Th2免疫應(yīng)答的水平，IFN-γ生物學(xué)功能主要為誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，提高Th1細(xì)胞數(shù)量及其活力；拮抗IL-4誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生IgE、IgG；調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞參與抗原遞呈和特異性免疫識(shí)別過(guò)程。IL-4主要促進(jìn)B細(xì)胞的增殖，活化和分化；促進(jìn)T細(xì)胞向Th2型細(xì)胞分化；拮抗IFN-γ的分泌和功能。IFN-γ/IL-4的比值變化可代表Th1/Th2免疫平衡狀況[4-6]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺處理小鼠血清Th1類細(xì)胞因子IFN-γ明顯降低；Th2類細(xì)胞因子IL-4明顯增高；IFN-γ/IL-4比值明顯下降，由此可以判定環(huán)磷酰胺胺處理小鼠存在明顯的Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)失衡，乳鐵蛋白50、500 mg對(duì)Th1/Th2免疫應(yīng)答有一定的影響，可通過(guò)提高IFN-γ/IL-4比值，促進(jìn)Th1/Th2免疫平衡的重建，完成其對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

乳鐵蛋白是一種具有多種生物功能活性的蛋白質(zhì)，相關(guān)研究表明，乳鐵蛋白具有促進(jìn)抗體生成、T細(xì)胞成熟、淋巴細(xì)胞增殖、活化自然殺傷細(xì)胞等多種免疫調(diào)節(jié)功能[7]。乳鐵蛋白對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。

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[1]胡志和,龐廣昌,陳慶森.牛乳鐵蛋白及乳鐵素的生產(chǎn)與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].食品科學(xué),2006,27(6):247-251

[2]胡志和,劉傳國(guó),龐廣昌,等.乳鐵素免疫調(diào)節(jié)功能評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué),2009,30(15):200-204

[3]吳亞娣.Th1/Th2細(xì)胞的表面受體及其功能調(diào)節(jié)[J].上海免疫學(xué)雜志,2000,20(5):318-320

[4]顧國(guó)浩,彭群新.Th1/Th2細(xì)胞的免疫功能變化及其意義[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢測(cè)學(xué)分冊(cè),2003,24(6):333-334

[5]胡志和,劉傳國(guó),龐廣昌,等.乳鐵素免疫調(diào)節(jié)功能評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué),2009,30(15):200-204

[6]袁穎,金素安,何世民.中藥對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥雜志,2011,45(5):90-93

[7]胡志和,李娜,劉傳國(guó).乳鐵蛋白免疫增強(qiáng)作用評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué),2010,31(11):244-247

Protection of Lactoferrin Aganist Immune Injury of Cyclophosphamide in Mice

LI Zhao-xia1，ZHANG Qiu-xia1，ZHAO Hui1，WANG Ping2
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100069，China；2.Beijing Dong Ming Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Beijing 100069，China）

Abstract：To observe the protection of lactoferrin aganist immune injury of cyclophosphamide in mice.Balb/c mice were randomly divided into six groups——normal group，model group，four doses of lactoferrin groups.The normal group mice were administrated by saline solution without injection of cyclophosphamide.The model group mice were injected cyclophosphamide after intragastric administration of saline solution 27 days continuously.The four doses of lactoferrin groups mice were injected cyclophosphamide（5，25，50，500 mg/kg） through intraperitoneal injection after intragastric administration of correlative dose of lactoferrin 27 days continuously and then administrated by correlative dose of lactoferrin to the 30th days.After the last administration，peripheral blood CD4+T-cells and CD8+T-cells were measured by radioimmunoassay and the levels of serum cytokines of IL-2，IFN-γ，IL-4 and IL-10 were measured by enzyme-linked immunoassay.In comparison with normal group，the percentage of CD4+T-cells and CD8+T-cells were increased ，the levels of serum IFN-γ were decreased obviously （p<0.01），the levels of serum of IL-4 were increased obviously（p<0.05），the ratio of IIFN-γ and IL-4 was decreased obviously （p<0.01） in model group.Peripheral blood CD4+T-cells and CD8+T-cells were decreased obviously in 25 mg/kg and 50 mg/kg as well as 500 mg/kg doses of lactoferrin （P<0.01 or P<0.05）.The levels of serum of IFN-γ were increased obviously in 500 mg/kg dose of lactoferrin in comparison with model group （p<0.05）.The ratio of IFN-γ/IL-4 was inclined to normal level in 50 and 500 mg/kg doses of lactoferrin groups.The lactoferrin had the protection function of restoration of immune imbalance of mice due to cyclophosphamide.

Key words：lactoferrin；cyclophosphamide；immune function

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.032

李朝霞（1977—），女（漢），講師，博士，研究方向：中藥新藥的開發(fā)與應(yīng)用。

2012-12-17