張妍楠，姚曉玲，2，*，袁奇，馮桂仁，張國真

（1.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥學(xué)院，湖北武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430068）

兩種類型MCM-41固定化效果的比較

張妍楠1，姚曉玲1，2，*，袁奇1，馮桂仁1，張國真1

（1.湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥學(xué)院，湖北武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430068）

摘 要：本文研究了鈉型MCM-41和氫型MCM-41介孔材料在不同固定化條件下對(duì)固定化酶活性及酶活性回收率的影響。結(jié)果表明，不同固定化條件下，以氫型MCM-41介孔材料為載體時(shí)，固定化酶活性及酶活性回收率較高，說明氫型MCM-41介孔材料相對(duì)于鈉型MCM-41有較好的固定化效果。

關(guān)鍵詞：MCM-41介孔材料；固定化酶；木瓜蛋白酶；效果

MCM-41是一類孔徑在2.0 nm～50.0 nm之間可調(diào)節(jié)的多孔納米材料[1-2]。具有孔道高度有序、孔隙率高和比表面較大等特點(diǎn)。關(guān)于介孔材料MCM-41的制備已有較多探索[3-7]，目前主要集中在小孔MCM-41固定化研究方面[8-13]。肖寧[14]曾采用加入擴(kuò)孔劑間三甲苯（TMB）的方式對(duì)納米材料MCM-41進(jìn)行了制備，得到了Na離子接在骨架結(jié)構(gòu)鍵上的新型MCM-41介孔材料，可稱之為“鈉型MCM-41”，該材料不僅擴(kuò)大MCM-41納米材料孔徑，而且提高固定化木瓜蛋白酶酶活性回收率。將鈉型MCM-41介孔材料和HCl在一定條件下反應(yīng)，可制得H離子接在骨架結(jié)構(gòu)鍵上的改進(jìn)MCM-41介孔材料，稱之為“氫型MCM-41”。本文分別以鈉型MCM-41和氫型MCM-41介孔材料作為木瓜蛋白酶的固定化載體，研究了兩者對(duì)固定化酶活性及酶活性回收率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈉型MCM-41：揚(yáng)州中和石化研究所有限公司；木瓜蛋白酶、半光氨酸：Sigma公司；酪蛋白：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；EDTA、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀、戊二醛25%、三氯乙酸（TCA）：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

UV-2000紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；THZ-82A水浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；GL-21M智能高速冷凍離心機(jī)：長沙平凡儀器；FE20型pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SHB-111A循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 酶活性的測(cè)定

1.3.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用pH7.0的磷酸緩沖液[13]將L-酪氨酸配成0～100 μg/mL不同濃度的溶液，同時(shí)以磷酸緩沖液作為對(duì)照，在275 nm波長下測(cè)吸光值，以吸光值對(duì)酪氨酸濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為y=0.006 9x+0.012 5，R2=0.998 7，如圖1所示。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The normative pertinence of tyrosine

1.3.2 游離木瓜蛋白酶酶活的測(cè)定

在4.5 mL激活劑（0.1 mol/L的pH=7.0的磷酸緩沖液中含20 mmol/L半胱氨酸和1 mmol/L EDTA，現(xiàn)配現(xiàn)用）中加入0.5 mL的1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液，再加入5 g/L的酪蛋白溶液5 mL，于37℃的水浴鍋中，恒溫水浴10 min；反應(yīng)完畢立即加入5%三氯乙酸溶液5 mL終止反應(yīng)。對(duì)照則先加三氯乙酸溶液，再加酪蛋白溶液5 mL，其余操作相同。反應(yīng)終止后將樣品液和對(duì)照液于10 000 r/min、溫度10℃下離心15 min，所得上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，于275 nm下測(cè)吸光度[15]。測(cè)得游離木瓜蛋白酶酶活為15 U mol/s。

式中：A為樣品液的OD值；A0為對(duì)照液的OD值；V 為反應(yīng)液體積，15 mL；t為反應(yīng)時(shí)間，600 s；181.19為酪氨酸的分子量；K由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得常數(shù)。

1.4 固定化木瓜蛋白酶的制備及酶活的測(cè)定

1.4.1 固定化木瓜蛋白酶的制備

稱取0.25 g載體放入50 mL錐形瓶中，依次加入10 mL pH 7.0磷酸緩沖液、5 mL激活劑、1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液5 mL、滴加7.5%的戊二醛溶液至體積分?jǐn)?shù)為0.75%，置于恒溫水浴振蕩器中，轉(zhuǎn)速為180 r/min、15℃恒溫振蕩2 h。將反應(yīng)液過濾，所得濾渣經(jīng)磷酸緩沖液多次淋洗后的濾渣在36℃下烘干，制得固定化木瓜蛋白酶。

1.4.2 固定化酶酶活測(cè)定

稱取固定化木瓜蛋白酶0.1 g放入0.5 mL磷酸緩沖液中，按1.3.2所述方法進(jìn)行酶活測(cè)定。其它與上述游離酶的活性測(cè)定方法相同。

式中：A為樣品液的OD值；A0為對(duì)照液的OD值；V 為反應(yīng)液體積，15 mL；t為反應(yīng)時(shí)間，600 s；181.19為酪氨酸的分子量；K由標(biāo)準(zhǔn)曲線所得常數(shù)。

1.5 氫型MCM-41介孔材料的制備

以廠家提供鈉型MCM-41介孔材料為原料，按固液比1∶4（g/mL）與濃度為8%的鹽酸進(jìn)行混合。混合液于90℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h將上清液過濾，濾渣在馬弗爐中180℃下反應(yīng)45 min、260℃反應(yīng)30 min、320℃反應(yīng)30min，840℃反應(yīng)45min，500℃反應(yīng)90min，560℃反應(yīng)90 min直到600℃燒白為止，即可制得氫型MCM-41介孔材料。

2 固定化條件對(duì)酶活性回收率的影響

2.1 不同pH對(duì)固定化的影響

分別以兩種介孔材料為載體，對(duì)木瓜蛋白酶在不同的pH環(huán)境下進(jìn)行固定化，制得固定化酶的酶活性回收率如圖2所示。

圖2 pH對(duì)酶活性回收率的影響Fig.2 The influence of pH on activity recycle ratio

兩種介孔材料固定化反應(yīng)的最佳pH分別為6.5和7，而氫型MCM-41納米材料的固定化酶活性回收率整體高于鈉型MCM-41納米材料，原因可能是氫型MCM-41納米材料表面含有更多的弱酸性羥基，能較好的與木瓜蛋白酶（pl=8.75）發(fā)生中和反應(yīng)[16]，單位質(zhì)量吸附的酶量增加，使酶活性回收率提高。

2.2 固定化時(shí)間對(duì)酶活性回收率的影響

分別以兩種介孔材料為載體，控制固定化反應(yīng)時(shí)間（其他條件不變）所得固定化木瓜蛋白酶酶活性回收率，如圖3所示。分別以兩種納米材料為載體時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，酶活性回收率都出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象且最大酶活性回收率所需反應(yīng)時(shí)間分別為2 h和3 h。但氫型MCM-41納米材料的固定化酶活性回收率整體高于鈉型MCM-41納米材料，其原因可能是進(jìn)入孔道的部分木瓜蛋白酶與氫型MCM-41納米材料內(nèi)的羥基作用初始速度較鈉型MCM-41快，或者部分木瓜蛋白酶分子對(duì)鈉型MCM-41納米材料的孔口堵塞較嚴(yán)重，使得其他酶分子不能進(jìn)入孔道參與固定化反應(yīng)。

圖3 時(shí)間對(duì)酶活性回收率的影響Fig.3 The influence of time on activity recycle ratio

2.3 不同溫度對(duì)酶活性回收率影響

分別以兩種介孔材料為載體，對(duì)木瓜蛋白酶在不同的溫度條件（其他條件不變）下固定，制得固定化木瓜蛋白酶酶活性回收率，如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)酶活性回收率的影響Fig.4 The influence of temperature on activity recycle ratio

隨著溫度的升高，載體交聯(lián)酶量增加，分別被兩種材料固定的木瓜蛋白酶酶活性回收率都呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，且最適固定化溫度為15℃，但以氫型MCM-41為載體所得固定化酶活性回收率整體高于鈉型MCM-41，可能原因是氫型MCM-41材料的孔徑比鈉型MCM-41大，表面積隨之增大，所固定的木瓜蛋白酶的量就越多，酶活性回收率增大。

2.4 不同戊二醛濃度對(duì)酶活性回收率影響

圖5 戊二醛濃度對(duì)酶活性回收率的影響Fig.5 The influence of glutaraldehyde solution on activity yield

分別以兩種介孔材料為載體，對(duì)木瓜蛋白酶在不同的戊二醛濃度（其他條件不變）下固定，制得固定化木瓜蛋白酶的酶活性回收率，如圖5所示，隨戊二醛濃度的升高，分別被兩種材料固定的木瓜蛋白酶酶活性回收率出現(xiàn)先增大后減弱的趨勢(shì)，且最大酶活性回收率所需戊二醛濃度分別為0.5%和0.75%。但氫型MCM-41納米材料固定化酶活性回收率整體高于鈉型MCM-41納米材料，主要原因可能是氫型MCM-41納米材料孔徑增大，表面積隨之也增大，則木瓜蛋白酶進(jìn)入孔道的速度加快，被固定的木瓜蛋白酶量增多。而在戊二醛濃度較低的情況下鈉型MCM-41固定化酶活性回收率低的原因可能是游離木瓜蛋白酶在未進(jìn)入孔道之前就與戊二醛發(fā)生交聯(lián)，交聯(lián)后的酶分子較單個(gè)酶分子更難進(jìn)入孔道，固定的酶量減少則酶活性回收率降低；當(dāng)戊二醛濃度較高的情況下鈉型MCM-41固定化酶活性回收率低的原因可能是戊二醛濃度過高使游離的或固定化的木瓜蛋白酶部分變性失活，但氫型MCM-41納米材料孔徑大，交聯(lián)的酶量增多，相對(duì)降低了戊二醛在緩沖體系濃度，木瓜蛋白酶活性損失少，故氫型MCM-41納米材料的酶活性回收率下降的慢。

2.5 振蕩速度對(duì)酶活性回收率影響

分別以兩種介孔材料為載體，對(duì)木瓜蛋白酶在不同的振蕩速度（其他條件不變）下固定，制得固定化木瓜蛋白酶酶活性回收率，如圖6所示。

圖6 振蕩速度對(duì)酶活性回收率的影響Fig.6 The influence of shaking speed on activity yield

隨著振蕩速度的加強(qiáng)，分別被兩種材料固定的木瓜蛋白酶酶活性回收率出現(xiàn)先增大后減弱的趨勢(shì)，且最大酶活性回收率所需最佳振蕩速度為180次/min。兩種材料固定的木瓜蛋白酶酶活性回收率先增大的主要原因?yàn)檎袷幩俣鹊脑黾樱d體交聯(lián)反應(yīng)的速度加快，其酶活性回收率升高并達(dá)到最大值，但隨著振蕩速度的繼續(xù)增大，被固定的木瓜蛋白酶由于外力的增強(qiáng)容易發(fā)生脫落，使得固定化的木瓜蛋白酶的酶活性回收率降低。但氫型MCM-41納米材料固定化酶酶活性回收率整體高于鈉型MCM-41納米材料，可能原因是氫型MCM-41納米材料比鈉型MCM-41納米材料做為載體與木瓜蛋白酶交聯(lián)作用要強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文制備了氫型MCM-41納米材料并對(duì)木瓜蛋白酶進(jìn)行固定化，同時(shí)與鈉型MCM-41納米材料進(jìn)行比對(duì)研究，實(shí)驗(yàn)表明氫型MCM-41納米材料對(duì)木瓜蛋白酶在不同的固定化條件下所得酶活性回收率整體較好于鈉型MCM-41納米材料，說明氫型MCM-41介孔材料相對(duì)于鈉型MCM-41有較好的固定化效果，因而具有更好的應(yīng)用前景。

：

[1]Kresge C T,Leonowicz M E,Roth W J,et al.Ordered mesoporous molecular sieves synthesized by a liquid-crystal template mechanism[J].Nature,1992,359(6397):710-712

[2]Beck J S,Vartuli J C,Roth W J,et al.A new family of mesoporous molecular sieves prepared with liquid crystal templates[J].Journal of the american chemical Society,1992,114(27):10834-10843

[3]禹劍,王連洲,施劍林.低表面活性劑/硅比率中有序介孔材料的合成[J].無機(jī)材料學(xué)報(bào),2000,15(1):55-61

[4]王艷君.介孔分子篩MCM-41的合成及其孔道中脂肪酶的固定化研究[D].杭州:浙江大學(xué),2006

[5]孟桂花.MCM-41分子篩的制備及催化性能研究[J].當(dāng)代化工,2011,40(11):1103-1106

[6]楊燕,張玥,趙悅,等.新型納米MCM-41合成研究[J].廣東化工,2012,39(14):40-41

[7]黨在清,楊建高,趙彥生.MCM-41納米粒子的制備[J].化工技術(shù)與開發(fā),2010,39(6):1-3

[8]Diaz J F,Balkus Jr K J.Enzyme immobilization in MCM-41 molecular sieve[J].Journal of molecular catalysis B:enzymatic,1996,2(2):115-126

[9]Wang Y,Zheng X H,Jiang Z H.Ordered mesoporous materials for biology and medicine[J].Prog Chem,2006,18(10):1345-1351

[10]肖寧,趙斌超,王艷輝,等.介孔分子篩MCM-41固定化胰蛋白酶的研究[J].食品工業(yè)科技,2005,26(10):151-153

[11]趙斌超.介孔分子篩固定化酶的研究[D].北京:北京化工大學(xué),2005

[12]王艷君.介孔分子篩MCM-41的合成及其孔道中脂肪酶的固定化研究[D].杭州:浙江大學(xué),2006

[13]肖寧.介孔分子篩MCM-41固定化酶的研究[D].北京:北京化工大學(xué),2005

[14]肖寧,趙炳超,馬潤宇.納米材料MCM-41的制備及其固定化酶的研究[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào),2006,33(1):8-11

[15]施特爾馬赫B.酶的測(cè)定方法[M].錢嘉淵,譯.北京:中國輕工業(yè)出版社,1992:242-253

[16]趙元藩,丁認(rèn)全.木瓜蛋白酶的加工工藝及應(yīng)用[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(bào),1999,19(5):46-48

The Comparison of Immobilized Effect on the Two Kinds of MCM-41 Mesoporous Materials

ZHANG Yan-nan1，YAO Xiao-ling1，2，*，YUAN Qi1，F(xiàn)ENG Gui-ren1，ZHANG Guo-zhen1
（1.College of Biological and Pharmaceutical，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，Hubei，China；2.Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation，Wuhan 430068，Hubei，China）

Abstract：In this work， the influence of different immobilization conditions on the enzyme activity and the enzyme activity yield with sodium MCM-41 and hydrogen MCM-41 mesoporous materials were studied.The results showed that higher enzyme activity and enzyme activity yield was obtained by using hydrogen MCM-41 mesoporous materials as the carrier under different immobilized conditions.These suggest that hydrogen MCM-41 mesoporous materials had better immobilized effect than sodium MCM-41 mesoporous materials.

Key words：MCM-41 mesoporous materials；immobilized enzyme；papain；effect

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.030

張妍楠（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工學(xué)基礎(chǔ)。

姚曉玲（1962—），女（漢），教授，主要從事食品加工技術(shù)研究工作。

2013-01-18