雷云，戴明，周鵬，鄭小嚴(yán)，林欽，歐陽立群

（1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系，福建福州 350004；2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建福州 350002）

水產(chǎn)品及螺旋藻片中微囊藻毒素檢測方法研究

雷云1，戴明2，*，周鵬2，鄭小嚴(yán)2，林欽2，歐陽立群2

（1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析系，福建福州 350004；2.福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建福州 350002）

摘 要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品及螺旋藻片中微囊藻毒素的高靈敏度色質(zhì)聯(lián)用快速檢測方法。樣品經(jīng)溶劑超聲提取、固相萃取凈化，氮?dú)獯抵两刹⒍ㄈ莺?，通過超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀檢測。分離柱為 Waters Acquity BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm× 100 mm）；流動相為 0.3% 甲酸水溶液-乙腈；流速 0.4 mL/min。4種不同基質(zhì)樣品中有害毒素微囊藻毒素MCYST-RR和MCYST-LR的檢測限分別為0.7 μg/kg和0.3 μg/kg。4種不同基質(zhì)樣品中微囊藻毒素的回收率為80.0%～103.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.2%～14.6%（n=5），在0.01 μg/mL～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)r2均大于0.999。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；水產(chǎn)品；螺旋藻片；微囊藻毒素

微囊藻毒素（簡稱MCYSTs）是在藍(lán)藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)毒量最大的一類藻類毒素，由于其生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，日益引起人們的關(guān)注[1]。MCYSTs是一類單環(huán)7肽，至21世紀(jì)初已確定的MCYSTs的同分異構(gòu)體已達(dá)60多種，其中研究最多兩種變體為MCYST-RR與MCYST-LR[2]。微囊藻毒素具有強(qiáng)烈的促癌作用，我國南方原發(fā)性肝癌的高發(fā)病率被認(rèn)為與飲水中的藻毒素污染有關(guān)[3]。微囊藻毒素作用的靶器官是肝臟，微囊藻毒素能強(qiáng)烈地抑制蛋白磷酸酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的過磷酸化，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷[4]。微囊藻毒素的檢測方法包括蛋白磷酸酶抑制分析PPIA法、ELISA法、HPLC法，前二者易出現(xiàn)假陽性，受其他物質(zhì)干擾嚴(yán)重，后者樣品前處理復(fù)雜、靈敏度低[5-6]。此外，近年來利用生物傳感器檢測微囊藻毒素的方法也不斷出現(xiàn)，該方法具有前處離簡單、靈敏度高、分析周期短等優(yōu)點(diǎn)，但易受其他物質(zhì)干擾，尤其是復(fù)雜的水產(chǎn)品及食品基質(zhì)[7-8]。當(dāng)前色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，尤其是超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜具有分析速度快、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，日益廣泛地應(yīng)用于微囊藻毒素的檢測[9-11]。

采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜，比較分析不同的水產(chǎn)品樣品及螺旋藻片中微囊藻毒素的提取、凈化的方法，建立了高靈敏度色質(zhì)聯(lián)用檢測微囊藻毒素技術(shù)，為我們有效監(jiān)測食品中該類污染物的污染情況提供重要的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MCYST-RR和MCYST-LR標(biāo)準(zhǔn)品純度大于95%，購于TaiWan Algal Science Inc；所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純試劑，甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；甲酸：購自Acros公司，純度大于99%。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜儀配Agilent 6460 QQQ串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：美國安捷倫公司；高速冷凍離心機(jī)：美國貝克曼公司，Avanti J-E；12管固相萃取裝置：美國Supelco公司；Sonics VCX130PB超聲破碎儀：Sonics and Materials，Newtown，CT，USA。

1.3 試驗(yàn)樣品

鯽魚、蝦、河蚌和螺旋藻片樣品均購自市場。分別取鯽魚、蝦與河蚌肌肉組織，用清水沖去污物和泥沙，并用濾紙或者干凈紗布小心的吸去多余的水分，放入攪碎機(jī)中攪碎至勻漿狀；螺旋藻片樣品置于碾缽中磨細(xì)，置于-20℃冷凍備用。空白樣品經(jīng)分析均無MCYST-RR和MCYST-LR。

1.4 樣品制備

取上述樣品1.0g，置于離心管中，加入10mL丁醇∶甲醇∶水（1∶4∶15，體積比）混合溶液，于 4℃下用超聲破碎儀持續(xù)超聲3 min，并在12 000 r/min下高速離心10 min，移取上清液至干凈容器中避光保存。再次加入提取液，依上法重復(fù)提取3次，合并以上3次上清液。再于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，蒸去甲醇后，待用。

1.5 樣品凈化

移取10 mL甲醇，注入HLB固相萃取小柱，使液體自然滴下，當(dāng)甲醇液面接近小柱上層塞板時(shí)，加入10 mL純水活化。將上述樣品殘液加入已預(yù)先活化的HLB柱中進(jìn)行富集。待富集完畢，依次用20%甲醇水溶液淋洗，100%甲醇溶液洗脫。洗脫液收集于50 mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上依次蒸干，用于再次富集。吸取10 mL甲醇活化硅膠固相萃取小柱，使液體自然滴下，在活化、平衡、淋洗、洗脫過程中硅膠填料應(yīng)保持潤濕，不使其干涸。50 mL圓底燒瓶中樣品用2 mL甲醇溶出，并移至活化好的硅膠固相萃取小柱進(jìn)行富集。待富集完畢，依次用甲醇淋洗，70%甲醇洗脫。洗脫液收集于50 mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，取下圓底燒瓶，用1 mL甲醇分3次溶解樣品并轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，放入離心濃縮儀蒸干后加入1 mL純水溶解樣品，離心取上清液用于液相色譜-串接質(zhì)譜法測定。

1.6 色譜和質(zhì)譜條件

1.6.1 色譜條件

儀器：Agilent 1290 UHPLC；流動相：0.3%甲酸水溶液（A）+乙腈（B）；流速：0.4 mL/min；色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；柱溫：40℃；樣品盤溫度：4℃；洗脫程序：等度，80%A+20%B；進(jìn)樣量：5 μL。

1.6.2 質(zhì)譜條件

儀器：Agilent 6460型三重四極桿質(zhì)譜儀；電離源模式：電噴霧離子化；電離源極性：正離子模式；霧化氣：氮?dú)?N2；霧化氣壓力：50 psi；毛細(xì)管電壓：3 500 V；干燥氣溫度：325℃；干燥氣流速：5 L/min；鞘氣溫度：380℃；鞘氣流速：12 L/min；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；分辨率：Q1（unit）Q3（unit）。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

配制 1.0 μg/mL微囊藻毒素 MCYST-RR與MCYST-LR的水溶液，分別進(jìn)行進(jìn)行一級全掃描與二級全掃描機(jī)多反應(yīng)檢測（MRM）。為了獲得MCYST-RR和MCYST-LR檢測的最佳質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行有效定量，我們研究了相關(guān)的質(zhì)譜條件。通過優(yōu)化霧化氣壓力、毛細(xì)管電壓、干燥氣溫度與流速、鞘氣流速等參數(shù)，從而獲得有效的分子離子峰；同時(shí)還優(yōu)化了碎片碰撞能（CE）、毛細(xì)管出口端輸入電壓（Fragmentor voltage）以獲得最大的碎片離子響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）有效克服了實(shí)際樣品干擾組分較多，樣品背景較臟的缺點(diǎn)，通過檢測特定質(zhì)荷比的碎片離子峰，可以獲得的更高的選擇性和靈敏度，實(shí)現(xiàn)對MCYST-RR和MCYST-LR的準(zhǔn)確定量。并且一級正離子模式全掃描監(jiān)測實(shí)驗(yàn)表明：MCYST-RR的電離以二價(jià)正離子為主，[M+2H]2+呈現(xiàn)為基峰，m/z為519.8，同時(shí)還有少量的一價(jià)正離子[M+H]+產(chǎn)生，m/z為1 038.6。在ESI/MS分析中，一價(jià)與二價(jià)正離子對于確定微囊藻毒素的分子量與分子結(jié)構(gòu)具有重要作用。負(fù)離子檢測結(jié)果表明，MCYST-RR在該實(shí)驗(yàn)條件下未能檢測出其負(fù)分子型離子[M-H]-，m/z為1 036，其原因在于MCYST-RR在ESI/MS分析中產(chǎn)生的負(fù)離子較少，負(fù)離子檢測不靈敏。選擇m/z為519.8為MCYST-RR檢測的母離子，其最主要的碎片離子峰包括：m/z 135（[C9H11O+H]+）、m/z 103（[C5H10O2+H]+）、m/z 70.1（[C4H7N+H]+）；MCYST-LR的基峰為m/z 995.5，其最主要的碎片離子峰包括：m/z 134.9 （[C9H10+H]+）、m/z 212.9 （[Glu-Mdha+H]+）、m/z 599.2（[Arg-Adda-Glu+H]+）和 m/z 977.4（[M+H-H2O]+）。MCYST-RR與MCYST-LR兩種物質(zhì)的子離子掃描的色譜與質(zhì)譜圖見圖1和圖2，微囊藻毒素MCYST-RR與MCYST-LR的定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)如表1。

圖2 微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Product ion scan spectra for MCYST-RR與MCYST-LR

圖1 微囊藻毒素-RR與微囊藻毒素-LR的子離子掃描色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution of MCYST-RR與MCYST-LR

表1 微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR的MS/MS參數(shù)Table 1MS/MS parameters for MCYST-RR and MCYST-LR

2.2 色譜條件的選擇

在色譜分析過程中，分析柱采用Waters Acquity UPLC TM BEH C18柱，同時(shí)使用C18預(yù)柱保護(hù)分析柱。在考慮色譜柱的耐酸性能基礎(chǔ)上，本研究試驗(yàn)了純水、0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸和0.4%甲酸與乙腈作為流動相的分離效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.3%甲酸-乙腈作為流動相時(shí)獲得滿意的結(jié)果。在流動相中加入適量甲酸也有利于提高M(jìn)CYST-RR和MCYST-LR樣品的離子化效率和檢測響應(yīng)靈敏度。試驗(yàn)中我們比較了等度洗脫和梯度洗脫兩種洗脫模式，由于組織樣品復(fù)雜，干擾組分較多，為了有效改善峰形，提高樣品分離選擇性、減少脫尾并縮短分析時(shí)間，本研究選擇梯度洗脫模式，通過不斷改變流動相極性，使流出組分獲得合適的分離度。同時(shí)試驗(yàn)表明乙腈－水－甲酸體系相對于甲醇－水－甲酸體系具有更好的峰對稱性、分析物選擇性，獲得更好的分離效果，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾樣品的分析。并且本方法采用了最新的超高效液相色譜技術(shù)和1.7 μm粒徑的色譜柱，具有極高的分離效率，微囊藻毒素樣品在4min內(nèi)即完全分離MCYST-RR和MCYST-LR的保留時(shí)間分別為2.737 min和3.323 min。

2.3 樣品提取與凈化條件的選擇

在樣品提取過程中，我們比較了不同萃取溶劑對MCYST-RR和MCYST-LR提取回收率的影響。這些萃取溶劑包括甲醇、酸化甲醇（0.05%TFA）；EDTA·Na2（0.01 mol/L）-酸化甲醇（0.05%TFA）；5%乙酸水溶液、丁醇∶甲醇∶水（1∶4∶15，體積比）混合溶液。實(shí)驗(yàn)表明丁醇∶甲醇∶水（1∶4∶15，體積比）混合溶液提取MCYST-RR和MCYST-LR可以得到相對較好的回收率，提取液中丁醇的加入可有效破壞目標(biāo)物與肌肉組織的結(jié)合，從而提高對樣品的提取回收率。而甲醇、酸化甲醇（0.05%TFA）、EDTA·Na2（0.01 mol/L）-酸化甲醇（0.05%TFA）；雖然也可有效提取目標(biāo)組分，但由于甲醇尤其是酸化甲醇提取的組分更為復(fù)雜，易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，對目標(biāo)物的定量分析產(chǎn)出干擾。

在樣品凈化過程中，我們著重研究了以固相萃取為基礎(chǔ)的樣品凈化方法，在本研究中我們比較了單SPE柱方法和組合SPE柱方法，在單SPE柱方法中我們分別比較了C18、硅膠柱、Oasis HLB柱。Oasis HLB型固相萃取吸附劑是由親脂性的二乙烯基苯和親水性的N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體共聚而成的大孔聚合物，通過調(diào)節(jié)兩種單體比例可以獲得兩親平衡的吸附劑。研究表明單獨(dú)使用以上任一種SPE柱，均無法得到很好的凈化效果，樣品的電離抑制均大于50%。而就反相色譜柱而言HLB柱的樣品回收率明顯高于C18柱。通過組合HLB柱和硅膠柱可以有效的提高凈化效率，顯著的降低樣品的電離抑制。

2.4 分析方法確證

2.4.1 方法的選擇性

取魚肉（蝦肉、蚌肉和螺旋藻片）空白樣品1.0 g，按“1.4樣品制備”和“1.5樣品凈化”方法操作，獲得空白樣品的色譜圖；將一定濃度的MCYST-RR和MCYST-LR添加入魚肉（蝦肉、蚌肉和螺旋藻片）樣品，依同法操作，得相應(yīng)的色譜圖；試驗(yàn)結(jié)果表明在目標(biāo)組分出峰時(shí)間無干擾峰存在。

圖3 魚肉空白樣品與基質(zhì)加標(biāo)樣品MRM色譜圖（疊加）Fig.3MRM chromatograms of MCYST-RR and MCYST-LR in blank and spiked fish sample

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

配制 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 、10.0 μg/mL 7 個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，樣品濃度比為橫坐標(biāo)，做出MCYSTRR和MCYST-LR的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到MCYST-RR的線性方程為 y=1 810.6x-972.26，r2=0.998 4；MCYSTLR的線性方程為y=1 296.6x+554.7，r2=0.997 8；線性范圍為 0.01 μg/mL～10 μg/mL。同時(shí)分別配制 MCYST-RR和MCYST-LR的魚肉低濃度（0.1μg/g）的質(zhì)量控制樣品（QC），實(shí)驗(yàn)計(jì)算表明，MCYST-RR的方法檢測限（LOD）與方法定量限（LOQ）分別為 0.2 μg/kg與 0.7 μg/kg；MCYST-LR的LOD與LOQ分別為0.1μg/kg與0.3μg/kg。

2.4.3 提取回收率

取魚肉、蝦肉、蚌肉和螺旋藻樣品低、中、高3個(gè)濃度，分別加入低、中、高3個(gè)濃度（分別為10、50、100 μg/kg），按“1.4 樣品制備”和“1.5 樣品凈化”方法操作，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析。通過比較以上處理樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣所得峰面積之比計(jì)算各濃度點(diǎn)得平均方法回收率，見表2。

表2 4種不同基質(zhì)中微囊藻毒素-RR與微囊藻毒素-LR的樣品基質(zhì)加標(biāo)回收率（n=5）Table 2 The recovery of MCYST-RR and MCYST-LR in different matrix（n=5）

2.4.4 方法的精密度

按“1.4樣品制備”和“1.5樣品凈化”方法操作，分別配制MCYST-RR和MCYST-LR的魚肉、蝦肉、蚌肉和螺旋藻樣品低、中、高3個(gè)濃度（分別為10、50、100 μg/g）的質(zhì)量控制樣品（QC），每一濃度分析 5 次，連續(xù)測定3 d。從而求得本測定方法的精密度（QC樣品測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值），見表3。

表3 4種不同基質(zhì)中微囊藻毒素-RR與微囊藻毒素-LR高低濃度的日內(nèi)與日間精密度Table 3 The precision of MCYST-RR and MCYST-LR in different matrix

3 結(jié)論

本研究建立了水產(chǎn)品及食品中微囊藻毒素含量測定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。該方法可有效滿足產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)部門、水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)部門對水產(chǎn)品及食品中微囊藻毒素的快速靈敏檢測，為嚴(yán)格質(zhì)量管理監(jiān)控提供必要的技術(shù)支持，提高產(chǎn)品質(zhì)量水平，保障人民身體健康。

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Determination of Microcystins in Aquatic Products and Spirulina Powder Ablets by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LEI Yun1，DAI Ming2，*，ZHOU Peng2，ZHENG Xiao-yan2，LIN Qin2，OUYANG Li-qun2
（1.Department of Pharmaceutical Analysis，F(xiàn)aculty of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，F(xiàn)ujian，China；2.China National Quality Supervision and Testing Center for Processed Food，F(xiàn)ujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350002，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：A simple and rapid method was developed for the determination of microcystin-RR and microcystin-LR in aquatic product and spirulina powder ablets by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometric（UHPLC-MS/MS）.The analytes were extracted from aquatic products and spirulina powder ablets using butanol：methanol：water （1∶4∶15，volume ratio）with ultrasonication， followed by a solid-phase extraction （SPE）on Oasis HLB and silica cartridges.After the chromatographic separation on Waters Acquity BEH C18 （1.7 μm，2.1 mm×100 mm）column by 0.3%formic acid-acetonitrile isocratic elution， the analysis was carried out by UHPLC-MS/MS.The linear range of microcystins in aquatic products and spirulina powder ablets were 0.01 μg/mL-10 μg/mL （r2＞0.99） and the limits of detection were 0.7 μg/kg for MCYST-RR and 0.3 μg/kg for MCYST-LR.The recoveries were ranged from 80.0%-103.6% ， and the relative standard deviations were 2.2%-14.6%（n=5）.

Key words：UHPLC-MS/MS；aquatic products；spirulina powder ablets；microcystin

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.024

福建省自然科學(xué)基金（2009J05115&2010J05019）；福建省衛(wèi)生廳基金（2010-1-34）

雷云（1982—），女（畬），講師，博士，研究方向：藥物分析化學(xué)。