胡鑫鑫, 董 利，陳穎峰，黃小翰

( 茂名職業(yè)技術學院 化學工程系，廣東 茂名 525000)

對食品防腐劑的構效關系進行了大量研究后發(fā)現(xiàn)，α、β-不飽和羰基結(jié)構是防腐劑發(fā)揮抗菌作用的功能基團[1]。富馬酸及其酯類衍生物即是一種含有該官能團的高效、廣譜抗菌防腐劑。其中, 富馬酸二甲酯(DMF)即是一個具有代表性的富馬酸酯類衍生物，但由于富馬酸二甲酯易升華、刺激性氣味重，且對人皮膚和黏膜具有強烈的刺激作用，因而限制了其在食品方面的應用。為消除富馬酸二甲酯的過敏性及升華性, 并保留其α、β不飽和羰基功能結(jié)構，本研究在富馬酸分子的一端引入水楊酸甲酯，使其羧基與其酯化，另一端羧基引入甲醇，使其甲酯化，合成出新型防腐劑反丁烯二酸水楊酸甲酯(Methyl Salicylate Methyl Fumarate, MSMF)，對合成產(chǎn)物進行表征，并對其抗菌活性進行研究，同時與目前常用的抗菌劑進行比較。

1 實驗材料與儀器

(1) 實驗藥品：無水甲醇、順丁烯二酸酐、無水AlCl3、水楊酸甲酯、乙醇、二氯亞砜、氫氧化鈉、溴化鉀、碳酸氫鈉（以上試劑均為分析純）；營養(yǎng)肉湯、培養(yǎng)基蛋白胨、麥芽汁、葡萄糖、瓊脂牛肉膏（以上均為生化試劑）。

(2) 供試菌種：大腸桿菌(Eschericheae coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)、面包酵母(Saccharomyces panis fermentati)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavous)（以上菌種由茂名職業(yè)技術學院微生物實驗室提供）及牛奶酸敗混合菌群（室溫貯存牛奶酸敗后分離所得）。

(3) 供試抗菌劑：苯甲酸鈉、苯甲酸、山梨酸鉀、山梨酸、尼泊金甲酯、丙酸鈣（以上試劑均為食品級），反丁烯二酸水楊酸甲酯（自己合成）。

(4) 實驗儀器： JB50-D 増型 力電動攪拌機，DGSY電熱恒溫水浴鍋， THZ -82型恒溫振蕩器，PHS-25型pH計，X-4型顯微熔點儀（溫度計未校正），手提式壓力蒸汽滅菌器， AVATAR360FT紅外光譜儀，UV2401PC型紫外-可見分光光度計。

(5) 細菌培養(yǎng)基的制備：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖10 g、水1 000 mL、調(diào)節(jié)pH至7.6～7.8，121 ℃滅菌30 min，用于枯草桿菌、培養(yǎng)[2]；麥芽汁培養(yǎng)基：取130 g麥芽汁培養(yǎng)基溶于1 000 mL蒸餾水中，約達12°Bx，加入瓊脂20 g煮沸使瓊脂充分溶解，121 ℃滅菌30 min，用于酵母培養(yǎng)。

2 反丁烯二酸水楊酸甲酯合成與表征

2.1 反丁烯水楊酸甲酯的合成

2.1.1 合成原理

以順丁烯二酸酐、水楊酸甲酯和甲醇為原料，采用三步反應合成目標產(chǎn)物反丁烯二酸水楊酸甲酯：第一步，順酐在加熱條件下先與甲醇酯化，再經(jīng)無水AlCl3異構化后生成反丁烯二酸單甲酯；第二步，加入二氯亞砜使反丁烯二酸單甲酯酰氯化，生成反丁烯二酸單甲酯單酰氯；第三步，反丁烯二酸單甲酯單酰氯再與甲醇酯化得到反丁烯二酸水楊酸甲酯。合成路線見圖1[2-5]。

圖1 反丁烯二酸水楊酸甲酯的合成路線Fig.1 Synthetic route of MSMF

2.1.2 操作步驟

在裝有溫度計、回流冷凝管和電動攪拌器的250 mL三口燒瓶中按1.0︰1.1的配比加入順丁烯二酸酐和無水甲醇，水浴加熱，在 60 ℃條件下攪拌反應30 min，然后升溫至80 ℃后加入占反應物總質(zhì)量3%異構化催化劑無水AlCl3，保溫反應2 h。冷卻至室溫，用飽和KHCO3溶液溶解、過濾，濾液加濃鹽酸中和至 pH=3～4，析出白色固體，抽濾、水洗，用80 ℃的 20%乙醇－水溶液重結(jié)晶，45 ℃真空干燥24 h，得白色片狀晶體即反丁烯二酸單甲酯[6]。

在通風櫥中，向裝有回流冷凝管（冷凝管上端接氯化鈣干燥管，尾氣通入0.2 kg/L NaOH 溶液中）的100 mL的圓底燒瓶中，按摩爾比為1.0︰2.2的比例加入反丁烯二酸單甲酯和氯化亞砜，油浴加熱回流 45 min。反應結(jié)束后，常壓蒸出未反應的亞硫酰氯后減壓蒸餾，減壓蒸餾收集118～122℃/0.09 MPa餾分，得到無色透明油狀液體反丁烯二酸單甲酯單酰氯[7]。

在裝有電磁攪拌、溫度計、恒壓滴液漏斗的三口燒瓶中，加入水楊酸甲酯，冰水浴下緩慢滴加一定量的反丁烯二酸單甲酯單酰氯，反應30 min。將反應液滴加到飽和 NaHCO3溶液中，分離上層析出的淡黃色蠟狀物，水洗至中性，再用80 ℃的20%乙醇－水溶液重結(jié)晶所得晶體真空干燥即為產(chǎn)品。

2.2 產(chǎn)物表征

2.2.1 熔點測定

X-4型顯微熔點儀測得反丁烯二酸水楊酸甲酯熔點為125～126 ℃。

2.2.2 紫外光譜法

將待測試樣配成一定濃度的乙醇溶液，利用UV2401PC型紫外-可見分光光度計檢測樣品的紫外吸收特性。樣品在219 nm處有強吸收帶，這是α、β不飽和羰基結(jié)構的特征吸收，同時在297 nm處有一強且寬的吸收峰，可以推測這是芳香族化合物特征吸收[8]。

2.2.3 紅外光譜法

用 VECTOR33FT-IR紅外光譜儀測定反丁烯二酸水楊酸甲酯的紅外譜圖，采用溴化鉀壓片，紅外譜圖見圖2，特征吸收峰及可能對應的官能團見表1。

圖2 反丁烯二酸水楊酸甲酯紅外光譜圖Fig. 2 IR spectrogram of MSMF

表1 反丁烯二酸水楊酸甲酯的紅外吸收特征值Table 1 IR Spectrum of MSMF

3 反丁烯水楊酸甲酯的抑菌活性研究

3.1 最低抑菌濃度（MIC）測定

用試管稀釋法測定細菌的MIC，用平板涂布法測定酵母及霉菌的MIC[9]。結(jié)果見表2。

表2 MSMF對各菌種的最低抑菌濃度Table 2 The MIC of and several other preservatives

通過表2可看出，反丁烯二酸水楊酸甲酯的抑菌普較廣，對這不同的細菌、酵母及霉菌均有較強的抑制作用，且對上述菌種的最低抑菌濃度明顯低于常用抗菌劑苯甲酸和山梨酸。

3.2 不同防腐劑對各菌種的生長抑制

用比濁法測定對細菌和酵母的生長抑制試驗，用干重法對霉菌的生長抑制[9]。實驗結(jié)果見圖2-圖6。

圖3 對大腸桿菌的抑菌率曲線Fig.3 Effect on growth rate of Escherichia coli

圖4 對枯草桿菌的抑菌率曲線Fig.4 Effect on growth rate of Bacillus subtilis

圖5 對面包酵母的抑菌率曲線Fig.5 Effect on growth rate of Saccharomyces fermentati

圖2 和圖3為分別添加0.05%的反丁烯二酸水楊酸甲酯、苯甲酸、山梨酸及富馬酸二甲酯對大腸桿菌和枯草桿菌的抑菌率曲線。由圖可以看出MSMF對大腸桿菌和對枯草桿菌的抑菌半衰期大約均為36 h左右，對細菌的抑菌效果明顯優(yōu)于苯甲酸和山梨酸，與富馬酸二甲酯接近。

啤酒酵母和面包酵母是酵母中的典型菌種，廣泛分布在食品原料及土壤中。實驗研究了添加量為0.05%時四種供試防腐劑對啤酒酵母和面包酵母的抑菌率曲線，結(jié)果如圖4、圖5所示。由圖可知，20 h后，反丁烯二酸水楊酸甲酯的抑菌率仍然在90%以上，40 h后抑菌率仍然可達50%，其抑菌半衰期長達40 h以上，對酵母的抑菌效果遠優(yōu)于苯甲酸和山梨酸，略優(yōu)于富馬酸二甲酯。

圖6 對啤酒酵母的抑菌率曲線Fig.6 Effect on growth rate of Saccharomyces cerivisiae

圖7 反丁烯二酸水楊酸甲酯對黑曲霉的抑菌率曲線Fig.7 Effect of MSMF concentration on Aspergillus niger growth amount

圖7 為反丁烯二酸水楊酸甲酯及幾種常用防腐劑對黑曲霉的抑菌率曲線，從圖中可看出，反丁烯二酸水楊酸甲酯的抑菌半衰期長達140 h以上。而在60 h后，苯甲酸、山梨酸、DMF、MSMF的抑菌率分別為48%、53%、76%和94%，120 h后，前三者抑菌率分別下降到9%、25%、44%，反丁烯二酸水楊酸甲酯的抑菌率仍可高達62%，說明MSMF對霉菌有較強的抑制作用，抑菌效果優(yōu)于對照組3種常用防腐劑。

3.3 不同pH條件下食品防腐劑抑菌效果比較

目前市場現(xiàn)有各種食品防腐劑種類多為酸型防腐劑，只有在pH=4.5~3.5范圍內(nèi)才能有良好的抗菌效果，在中性或堿性條件下無任何抗菌效能，因此其使用范圍受到較大的限制。此實驗結(jié)果表明，反丁烯二酸水楊酸甲酯不但殺菌譜廣，殺滅微生物種類多，且不受食品酸堿性的影響（見表3、表4）。這對擴大應用范圍極為有利，因此，MSMF具有極為廣闊的應用推廣前景[10-12]。

表3 不同pH條件下GSMF與常用食品防腐劑抑菌效果（MIC值）比較Table 3 The antimicrobial capability of antiseptic in different pH %

3.4 反丁烯二酸水楊酸甲酯的耐熱性研究

取直徑為2 cm的濾紙圓片若干片，侵入0.1%的MSMF溶液中，半分鐘后取出、晾干，然后置于溫度為 100 ℃的干燥箱中，加熱處理，于不同時間分別取出濾紙圓片，置于帶有牛奶腐敗混合菌的細菌培養(yǎng)基平板中央，于(28±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，觀測抑菌圈直徑的大小[10]。實驗結(jié)果見表5。

表5 MSMF的耐熱性實驗Table 5 Heat resistance results of the MSMF

含有MSMF的濾紙片在100 ℃下處理2 h、4 h和6 h后對供試菌群的抑菌圈直徑較未進行熱處理的略有減小，其中，經(jīng)熱處理2 h后的抑菌圈直徑為2.8 cm，經(jīng)熱處理4 h和6 h后的抑菌圈直徑均為2.5 cm，與未經(jīng)加熱處理的含的濾紙片抑菌圈直徑2.8 cm相近，這表明受熱不易分解，不升華，熱穩(wěn)定性較好。

4 結(jié)束語

以順酐、水楊酸甲酯和甲醇為原料，合成反丁烯二酸水楊酸甲酯的方法為：順酐經(jīng)甲酯化后異構化得到反丁烯二酸單甲酯，單甲酯酰氯化后得到反丁烯二酸單甲酯單酰氯，再與水楊酸甲酯酯化后即可得到目標產(chǎn)物反丁烯二酸水楊酸甲酯。

抑菌實驗表明：（1）反丁烯二酸水楊酸甲酯不但抑菌譜較廣，對常見的細菌、酵母、霉菌均有較強的抑制作用，且抑菌效果明顯優(yōu)于常用防腐劑苯甲酸和山梨酸；（2）反丁烯二酸水楊酸甲酯抑菌效果不受環(huán)境酸堿度、溫度影響，在不同pH值、溫度下均能有效殺滅細菌。

［1］ 寧正祥, 譚龍飛, 張德聰,等. 不飽和羰基化合物的分子結(jié)構特性與抗菌活性間的關系[J]. 應用化學, 1996,13（1）:38-42.

［2］ 周如金, 黃敏, 黃艷仙,等. 反丁烯二酸蔗糖甲酯合成路線探討[J].化學與生物工程, 2007, 24（12）:60-61.

［3］ 歐光南, 周常義,高芳. 反丁烯二酸芳香醇酯的合成及抑菌活性研究[J] .食品科學,2006, 27（11）:207-209.

［4］ 秦燕, 寧正祥, 吳崗,等. 富馬酸二酯類的合成及抗菌效果研究[J] .食品與機械, 1998, (1): 34-35.

［5］ 高建華,寧正祥,秦燕,等. 非對稱富馬酸類的合成及對西式火腿腸保鮮效果的研究[J] . 食品與機械, 1997,18(10): 25-28.

［6］ 曠春桃, 王貴武, 劉虎,等. 富馬酸單甲酯的合成及防霉效果研究[J]. 現(xiàn)代化工, 2006, 26（2）:212-214.

［7］ 袁加程, 劉長春. 富馬酸單甲酯- 3-沒食子酸異戊酯的合成與性能研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27（7）: 70-73.

［8］ LI Yan, NING Zheng-xiang. Study on Antimicrobial Activity and Stability of New Food Preservative Methyl-furfuryl Fumarate[J].JOURNAL OF YUNNAN AGRICULTURAL UNIVERSITY, 2005,20(4):548-551.

［9］ 馬振瀛，關小梅. 工業(yè)防霉[M]. 北京:輕工業(yè)出版社, 1983:83-96.

［10］戰(zhàn)宇. 丁烯二酸桂醇甲酯的合成及在荔枝防腐保鮮中的應用研究(博士學位論文)[D]. 廣州:華南理工大學, 2003.

［11］ 郭新竹. 新型防腐劑反丁烯二酸葡萄糖甲酯的合成與抗菌(博士學位論文)[D]. 廣州:華南理工大學, 2002.

［12］ Ballesteros S . Antibacterial effects and cell morphological changes in Staphylococus aureus subjected to low ethanol concentrations[J].Journal of Food Seienee,1993,58(2):435-438.