馬艷妮，王斌，鞏蓓，王芳，趙華路，張俊武，余佳

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005

MicroRNA (miRNA) 是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，以完全互補或不完全互補的形式與靶 mRNA結(jié)合，引起靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻譯進(jìn)而對靶基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控[1-2]。miRNA作為細(xì)胞內(nèi)一類重要的非編碼調(diào)控分子，它所介導(dǎo)的調(diào)控作用已經(jīng)被認(rèn)為是多細(xì)胞生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后水平的一種普遍調(diào)節(jié)方式[3-5]。隨著被鑒別miRNA數(shù)量的不斷增加和它們功能的陸續(xù)闡明，人們逐漸發(fā)現(xiàn)以miRNA為主導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)幾乎參與了各種生命活動的各個環(huán)節(jié)。

人 β-類珠蛋白基因的表達(dá)具有明顯的發(fā)育階段時空特異性，其表達(dá)限制在紅細(xì)胞鏈系內(nèi)并且由發(fā)育程序精確控制[6-7]。β-類珠蛋白基因作為研究真核基因表達(dá)調(diào)控非常好的模型而被廣泛研究，珠蛋白基因的啟動子、增強子及位于基因簇上游的位點控制區(qū) (LCR) 等順式調(diào)控元件以及調(diào)控珠蛋白表達(dá)的各種反式作用因子已經(jīng)研究得相對清楚，但調(diào)控珠蛋白基因的miRNA分子卻非常少。因此我們從紅系分化過程中差異表達(dá)的miRNA著手，希望找到直接或間接調(diào)控珠蛋白表達(dá)的miRNA分子。我們從芯片數(shù)據(jù)中找到63個在紅系分化過程中表達(dá)變化的miRNA，但通過軟件預(yù)測，這些 miRNA都與珠蛋白的3'UTR區(qū)沒有直接的相互作用。而在分化過程中逐漸上升的miR-24被預(yù)測可以靶向Sp1這一負(fù)調(diào)節(jié)珠蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。Sp1屬于 Sp/Kruppel轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛表達(dá)于各種組織，可與富含GC或 GT盒的DNA序列結(jié)合行使轉(zhuǎn)錄因子功能[8]。Sp1既可以正向促進(jìn)靶基因的表達(dá)，也可以通過轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用負(fù)調(diào)控一些靶基因[9-10]。我們在之前的研究中已證明Sp1對于珠蛋白的負(fù)調(diào)控作用。而 miR-24已被廣泛報道在多種腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等生物學(xué)過程[11-14]，但其在珠蛋白表達(dá)中的作用還未見報道。

我們發(fā)現(xiàn)miR-24在hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞以及 EPO誘導(dǎo)的造血干/祖細(xì)胞向紅系分化過程中表達(dá)上升，且miR-24的過表達(dá)能夠促進(jìn)K562細(xì)胞中 ε-和 γ-珠蛋白的表達(dá)。同時，miR-24確實可以通過與Sp13UTR區(qū)結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)Sp1的表達(dá)，其對于珠蛋白的調(diào)控作用依賴于Sp1。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

K562細(xì)胞和293T細(xì)胞從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心購買。淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque為Amersham Biotech公司產(chǎn)品。CD34+磁珠及分選試劑盒均為 Miltenyi Biotech公司產(chǎn)品。培養(yǎng)原代細(xì)胞所用細(xì)胞因子重組人白介素3 (rhIL-3)，重組人干細(xì)胞因子(rhSCF)，重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEpo) 均購自R&D公司。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。DharmafectI轉(zhuǎn)染試劑、miRNA mimic或inhibitor以及Sp1 siRNA均為Dharmacon公司產(chǎn)品。雙熒光檢測試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。提取 RNA所用 TRIZOl及反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。實時定量PCR所用試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品。實驗中所用抗體分別為：Sp1抗體 (Milipore)；-珠蛋白抗體 (Santa Cruz)；-珠蛋白抗體 (Santa Cruz)；GAPDH 抗體(Proteintech)。

1.2 細(xì)胞系的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

人髓性白血病細(xì)胞系 K562細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，每100 mL培養(yǎng)液中加入10 mL胎牛血清 (FCS)，100 U青霉素，100 μg鏈霉素。培養(yǎng)條件均為37 ℃，5% CO2及飽和濕度。K562細(xì)胞于誘導(dǎo)前1天更換新鮮的完全培養(yǎng)基，使其在誘導(dǎo)當(dāng)天處于對數(shù)生長期。于第2天向處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞中加入30 μmol/L氯高鐵血紅素誘導(dǎo)其向紅系分化。

1.3 CD34+造血干/祖細(xì)胞的分離

將所采集的新鮮臍帶血標(biāo)本以含 2 mmol/L EDTA的1×PBS按照1∶4體積進(jìn)行稀釋，并用淋巴細(xì)胞分離液 Ficoll-Hypaque (密度 1.077 g/mL)分離得到單個核細(xì)胞。單個核細(xì)胞進(jìn)一步經(jīng)CD34+磁珠分離得到 CD34+造血干/祖細(xì)胞，具體如下：2×108單個核細(xì)胞重懸于600 μL的分選緩沖液 (含 0.5% BSA的 PBS) 中，加入 200 μL的 FcR阻斷劑到上清中，抑制非特異的抗體結(jié)合。進(jìn)而加入200 μL的CD34多重分選微磁珠，6～12 ℃孵育30 min，后經(jīng)分選緩沖液洗滌1次，重懸于適當(dāng)體積的分選緩沖液中。將MS柱放在MACS磁鐵上，將細(xì)胞懸液加到柱子頂端，讓陰性細(xì)胞通過。把柱子移開分離器，用提供的塞子沖出陽性部分，分選緩沖液沖洗柱子，收集陽性細(xì)胞。

1.4 CD34+造血干/祖細(xì)胞的體外誘導(dǎo)紅系分化

分離得到的CD34+細(xì)胞，按照1×105cells/mL的密度將細(xì)胞接種于5 mm培養(yǎng)皿中，1×IMDM，30%進(jìn)口胎牛血清 (FCS)，1%牛血清白蛋白(BSA)，100 μmol/L β 巰基乙醇 (β-ME)，2 ng/mL重組人白介素3 (rhIL-3)，100 ng/mL重組人干細(xì)胞因子 (rhSCF)，60 mg/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，2 U/mL重組人促紅細(xì)胞生成素 (rhEpo)。

1.5 實時定量PCR

在分化的不同時間點收集細(xì)胞，根據(jù)TRIZOl操作說明，提取細(xì)胞總RNA。提取的總RNA定量后，對于蛋白編碼基因使用oligodT作為逆轉(zhuǎn)錄引物，對于 miRNA使用 miRNA特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。使用適量的cDNA作為PCR模板，BioRad CFX-96進(jìn)行PCR反應(yīng)，SYBR染料實時檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量，以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白編碼基因表達(dá)情況，以 U6為內(nèi)參分析 miRNA的表達(dá)情況。所使用引物序列見表1。

1.6 寡核苷酸轉(zhuǎn)染

miR-24及隨機(jī)寡核苷酸使用DharmafectI轉(zhuǎn)染試劑，按照操作說明轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，終濃度為60 nmol/L，轉(zhuǎn)染后24 h誘導(dǎo)向紅系分化。表型回復(fù)實驗使用 miR-24的抑制型寡核苷酸與Sp1 siRNA共轉(zhuǎn)染 K562細(xì)胞，終濃度各為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染后24 h誘導(dǎo)向紅系分化。

1.7 報告基因?qū)嶒?/h3>

將 Sp1 3UTR 區(qū)含 miR-24結(jié)合位點的300～500 bp序列克隆插入pMIR-reporter載體中，同時構(gòu)建含與 miR-24序列完全互補片段的pMIR-reporter作為陽性對照。使用搭橋的方法獲得Sp1 3UTR區(qū)miR-24結(jié)合位點突變的片段構(gòu)建相應(yīng)的突變克隆，所使用引物見表 1。0.4 μg pMIR-reporter質(zhì)粒，0.02 μg pRL-TK，與 5 pmoL miRNA mimic或隨機(jī)寡核苷酸對照共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞，按照雙熒光檢測試劑盒說明書操作，檢測報告基因表達(dá)水平。

1.8 Western blotting

收集細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，并將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后與兔抗人Sp1 (1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜 3次后與山羊抗兔二抗 (1∶10 000) 室溫孵育 2 h，TBST洗膜后經(jīng)ECL顯色，壓片，顯影。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

在數(shù)據(jù)分析過程中采用雙總體t檢驗，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義，標(biāo)注為*，P＜0.01標(biāo)注為**，P＜0.001標(biāo)注為***。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-24在紅系分化過程中表達(dá)上升

在 EPO誘導(dǎo)的造血干/祖細(xì)胞向紅系分化過程中，分別于第4天、8天、11天和 18天收集細(xì)胞檢測成熟 miR-24的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)隨著紅系分化的進(jìn)行，miR-24呈逐漸上升趨勢 (圖1A)。在 hemin誘導(dǎo)的 K562細(xì)胞紅系分化過程中，miR-24也表現(xiàn)出顯著的表達(dá)上調(diào)，且較原代造血干/祖細(xì)胞紅系分化過程中的上升更為明顯，如圖1B所示，提示其可能對珠蛋白的表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。

2.2 miR-24的過表達(dá)能夠促進(jìn) K562細(xì)胞中珠蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步明確 miR-24對于珠蛋白的調(diào)控作用，我們在K562細(xì)胞中過表達(dá)miR-24，從圖2A中可以看出miR-24在K562細(xì)胞中過表達(dá)成功。進(jìn)而hemin誘導(dǎo)這些細(xì)胞向紅系分化，在未誘導(dǎo)以及誘導(dǎo)48 h和72 h收集細(xì)胞檢測γ-及ε-珠蛋白的表達(dá)情況。如圖2B所示，miR-24的過表達(dá)能夠明顯促進(jìn)紅系分化過程中 γ-珠蛋白的表達(dá)，但在未誘導(dǎo)的情況下，miR-24的過表達(dá)對于珠蛋白無明顯影響。同樣 miR-24的過表達(dá)也能夠促進(jìn)紅系分化過程中 ε-珠蛋白的表達(dá)(圖 2C)。而且miR-24的過表達(dá)同樣能夠促進(jìn)γ-及 ε-珠蛋白蛋白的表達(dá) (圖2D)，這些結(jié)果充分說明miR-24確實能夠參與調(diào)控珠蛋白基因的表達(dá)。

2.3 miR-24靶向轉(zhuǎn)錄因子Sp1

為了明確 miR-24調(diào)節(jié)珠蛋白基因表達(dá)的機(jī)制，我們通過 Targetscan預(yù)測了 miR-24的靶基因，其中之一就是對珠蛋白表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子 Sp1，圖 3A顯示 Targetscan軟件預(yù)測的 Sp13UTR區(qū) miR-24的結(jié)合位點。我們進(jìn)一步通過報告基因?qū)嶒炞C明了 miR-24的過表達(dá)能夠抑制包含Sp1 3UTR區(qū)的報告基因的表達(dá)，而在Sp1 3UTR區(qū)miR-24的結(jié)合位點突變后這種抑制作用消失 (圖3B)，充分說明miR-24確實通過與 Sp1 3UTR區(qū)的相互作用介導(dǎo)了對報告基因的負(fù)調(diào)控。為了進(jìn)一步驗證Sp1是 miR-24的靶基因，我們在 K562細(xì)胞中過表達(dá) miR-24或抑制miR-24的表達(dá)后檢測Sp1蛋白和mRNA水平的變化。如圖3C所示，miR-24過表達(dá)后Sp1的蛋白水平確實出現(xiàn)明顯的下降，相反地，miR-24的抑制卻導(dǎo)致 Sp1蛋白水平的上調(diào)。同時，Sp1mRNA水平變化不明顯，說明 miR-24可能通過抑制Sp1翻譯影響其蛋白水平 (圖3D)。這些結(jié)果充分說明Sp1確實是miR-24的新的靶基因。

圖1 miR-24在紅系分化過程中表達(dá)上升Fig. 1 miR-24 increased during erythroid differentiation. (A) miR-24 increased during Epo-induced human CD34+HPCs erythroid differentiation for 4, 8, 11 and 18 days. (B) miR-24 increased during hemin-induced K562 cell erythroid differentiation for 0, 24, 48 and 72 hours.

圖2 miR-24能夠促進(jìn)紅系分化過程中γ-及ε-珠蛋白的表達(dá)Fig. 2 Overexpression of miR-24 improved the γ-and ε-globin gene expression during erythroid differentiation. (A)miR-24 was successfully overexpressed in K562 cells. (B) Overexpression of miR-24 improved the γ-globin gene expression in hemin-induced K562 cells for 48 h and 72 h. (C) Overexpression of miR-24 improved the ε-globin gene expression in hemin-induced K562 cells for 48 h and 72 h. (D) Overexpression of miR-24 improved the protein level of γ- and ε-globin gene expression in hemin-induced K562 cells.

圖3 Sp1是miR-24的新靶基因Fig. 3 Sp1 was a new target of miR-24. (A) A miR-24 binding site was predicted to be in 3' UTR of Sp1 by Targetscan. (B) The reporter assay showed that overexpression of miR-24 could repress the activity of luciferase and the repression was depended on the miR-24 binding site. (C) Western blotting of Sp1 in miR-24 overexpressing or repressing K562 cells. (D) mRNA level of Sp1 in miR-24 overexpressing or repressing K562 cells.

2.4 miR-24對于珠蛋白的正調(diào)控作用依賴于Sp1

miR-24能夠促進(jìn)珠蛋白的表達(dá)，又能通過轉(zhuǎn)錄后水平抑制 Sp1這一珠蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，那么miR-24是否通過靶基因Sp1行使其對珠蛋白的調(diào)控作用呢？我們通過表型回復(fù)實驗證明了 miR-24對于珠蛋白的調(diào)控作用確實依賴于 Sp1，即我們首先在 K562細(xì)胞中通過抑制型寡核苷酸抑制了miR-24的表達(dá)，在miR-24被抑制后，其靶基因Sp1的表達(dá)上調(diào)，同時 γ-及 ε-珠蛋白的表達(dá)被抑制。而在抑制 miR-24表達(dá)的基礎(chǔ)上使用 siRNA抑制 Sp1的表達(dá)，由miR-24抑制所引起的 Sp1升高被部分抑制，同時 Anti-miR-24對 γ-及 ε-珠蛋白的抑制作用也被回復(fù)，充分說明 miR-24確實通過調(diào)節(jié)其靶基因Sp1的表達(dá)調(diào)控珠蛋白的表達(dá)。

3 討論

圖4 miR-24通過調(diào)節(jié)Sp1的表達(dá)發(fā)揮對珠蛋白的調(diào)控作用Fig. 4 miR-24 regulated ε- and γ-globin gene expression through targeting Sp1. (A) Western blotting of Sp1 in K562 cells which were transfected with miR-24 inhibitors or miR-24 inhibitors combined with si_Sp1 for hemin induction 48 hours. (B) The repression of miR-24 in K562 cells by anti-24 and the suppression of Sp1 by si_Sp1. (C) Real-time PCR analysis of the expression of γ-globin in the above K562 cells. (D)Real-time PCR analysis of the expression of ε-globin in the above K562 cells.

miRNA是非編碼RNA中研究最為深入，作用機(jī)制相對明確的一大類調(diào)控分子，其功能廣泛，幾乎涉及生命活動的各個方面，如組織器官發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)菌和病毒感染、細(xì)胞代謝和癌癥發(fā)生與轉(zhuǎn)移等[15-16]。但關(guān)于miRNA在人 β-類珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)控中的報道卻非常少，這可能部分因為β-類珠蛋白基因，包括ε-，γ-，β-珠蛋白基因 3UTR非常短，根據(jù)軟件預(yù)測能與之結(jié)合的miRNA很少，因此限制了miRNA在這一領(lǐng)域的研究。miR-96是唯一一個報道的以γ-珠蛋白為靶基因的miRNA分子，其可以結(jié)合至 γ-珠蛋白基因的編碼區(qū)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)γ-珠蛋白的表達(dá)[17]。還有一些通過靶向珠蛋白表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，間接地調(diào)節(jié)珠蛋白表達(dá)，如miR-144 通過靶基因klfd特異性地調(diào)控 α-珠蛋白的表達(dá)[18]，miR-15a和 miR-16-1通過靶基因MYB參與13號染色體三體患者中胎兒血紅蛋白的高表達(dá)[19]。我們在研究中發(fā)現(xiàn) miR-24能夠促進(jìn)hemin誘導(dǎo)的 K562細(xì)胞中ε-和γ-珠蛋白的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)豐富了miRNA在珠蛋白調(diào)控領(lǐng)域的研究。且 miR-24對于珠蛋白的這種促進(jìn)作用依賴于對轉(zhuǎn)錄因子Sp1的抑制。轉(zhuǎn)錄因子Sp1被報道在人鼠雜交細(xì)胞系 A181γ中可與 β-類珠蛋白啟動子區(qū)及珠蛋白上游高敏位點結(jié)合，并募集組蛋白去乙酰化酶從而抑制珠蛋白的表達(dá)[20]。因此在紅系分化起始階段，Sp1結(jié)合于珠蛋白基因上游，募集組蛋白去乙?；?，使得組蛋白去乙?；Y(jié)合區(qū)域的染色質(zhì)喪失轉(zhuǎn)錄活性。而miR-24能夠抑制Sp1的表達(dá)，使Sp1表達(dá)下降，珠蛋白基因上游DNA區(qū)域被釋放，進(jìn)一步通過蛋白相互作用募集 PCAF組蛋白乙?；甘沟媒M蛋白乙?；瘡亩せ钪榈鞍谆虻霓D(zhuǎn)錄。

miR-24已被廣泛報道參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等生物學(xué)過程，但關(guān)于其在珠蛋白表達(dá)中的調(diào)控作用，我們是首次報道。另外有一篇 miR-24參與調(diào)節(jié)紅系分化的報道，認(rèn)為miR-24通過靶向ALK4 (Activin type I receptor)阻斷 K562細(xì)胞對 activin A的反應(yīng)，從而抑制activin A所介導(dǎo)的紅系分化以及紅系分化過程中血紅蛋白的積累[21]。但在我們的研究中卻發(fā)現(xiàn)miR-24能夠促進(jìn)hemin誘導(dǎo)的k562細(xì)胞中珠蛋白的表達(dá)，說明不同信號所引發(fā)的紅系分化過程是不同的，而同一個分子也可能在兩個不同誘發(fā)劑所引起的相似過程中起不同作用。

總之，我們發(fā)現(xiàn) miR-24在紅細(xì)胞分化過程表達(dá)上調(diào)且對于珠蛋白的表達(dá)具有重要調(diào)控作用，miR-24的過表達(dá)可促進(jìn)hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞中 ε-、γ-珠蛋白的表達(dá)上升，且 miR-24對珠蛋白的促進(jìn)作用是通過抑制負(fù)調(diào)節(jié)珠蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Sp1實現(xiàn)的。

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