岳峰，郭雪娜，何秀萍，張博潤

1 中國科學(xué)院微生物研究所 酵母菌分子遺傳與育種實驗室，北京 100101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

高度重復(fù)序列廣泛存在于真核生物和一些原核生物的基因組中，銜接重復(fù)的DNA序列是基因組中高度動態(tài)化 (非?；钴S) 的成分。多數(shù)重復(fù)序列位于基因之間，但也有一些位于基因內(nèi)的編碼序列或假基因中。在高等真核生物中，這些基因內(nèi)重復(fù)序列數(shù)量的改變常常與某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如Huntington’s舞蹈癥、X型脆弱綜合癥等。作為單細(xì)胞真核生物，酵母菌基因組中也含有大量的高度重復(fù)序列，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因組中有 44個開放閱讀框 (Open reading frame，ORF) 存在基因內(nèi)重復(fù)序列 (http://www.sequence.standorf.edu/group/yeast)，它們多數(shù)編碼的是細(xì)胞表面蛋白。編碼絮凝蛋白的基因統(tǒng)稱為FLO基因家族，是酵母菌基因組中典型的含基因內(nèi)重復(fù)序列的基因，它們編碼的細(xì)胞表面糖蛋白通過和其他細(xì)胞表面的寡聚甘露糖鏈之間相互作用，使酵母細(xì)胞之間相互聚集形成絮狀或顆粒狀細(xì)胞團(tuán)，并迅速沉降到發(fā)酵液底部或漂浮到發(fā)酵液頂部，即產(chǎn)生絮凝表型[1-2]。不同的絮凝蛋白具有相似的模塊式結(jié)構(gòu)，即疏水的氨基端，主要參與配體 (糖分子或寡糖鏈) 的識別和相互作用；羧基端與 GPI錨定蛋白有很高的同源性，末端包括一個 GPI錨鉤；蛋白的中間區(qū)域是富含絲氨酸和蘇氨酸的高度重復(fù)序列，是發(fā)生 N-和 O-糖基化的主要區(qū)域[3-4](圖 1a)。編碼絮凝蛋白的基因中間存在大量銜接重復(fù)序列，它們驅(qū)動基因內(nèi)或基因間的滑移和重組，在產(chǎn)生絮凝特性多樣性的同時導(dǎo)致絮凝特性的遺傳不穩(wěn)定性，從而影響絮凝特性的可控應(yīng)用。

1 絮凝基因及基因內(nèi)重復(fù)序列

絮凝的發(fā)生是酵母細(xì)胞表面絮凝蛋白和其他細(xì)胞表面寡聚甘露糖鏈之間相互作用的結(jié)果，因此絮凝表型會受到游離糖分子的競爭性抑制[5]。根據(jù)對不同糖的敏感性，酵母菌的絮凝表型通常被分為絮凝型 (Flo1-type) 和新絮凝型(NewFlo-type) 兩種，其中前者只受甘露糖的抑制，而新絮凝型則受多種糖 (甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等) 的抑制。絮凝表型的差異取決于細(xì)胞內(nèi)編碼絮凝蛋白的基因序列。野生型釀酒酵母中編碼絮凝蛋白的基因主要有FLO1、FLO5、FLO9、FLO10、FLO11和Lg-FLO1，其中Lg-FLO1編碼的絮凝蛋白賦予酵母菌新絮凝表型，F(xiàn)LO11表達(dá)使酵母菌產(chǎn)生 Flo1型絮凝或類似生物膜結(jié)構(gòu)，其他基因的表達(dá)使酵母菌只產(chǎn)生 Flo1型絮凝，這些基因的共同特征是存在大量的基因內(nèi)重復(fù)序列 (圖1b)。FLO1位于染色體Ⅰ的右臂上，1994年日本的 Watari等報道了完整的FLO1基因序列，它含有一個 4 614 bp的ORF，編碼1 537個氨基酸組成的、富含絲氨酸和蘇氨酸的蛋白，ORF中66.97%的序列為銜接重復(fù)序列，根據(jù)其編碼氨基酸序列的一致性，這些重復(fù)序列可以劃分為4個重復(fù)單元，其中重復(fù)單元A是135 bp的核苷酸序列重復(fù)18次，重復(fù)單元B是60 bp的核苷酸序列重復(fù)2次，重復(fù)單元C是153 bp的核苷酸序列重復(fù)3次，重復(fù)單元 D是 27 bp的核苷酸序列重復(fù) 3次[6]；FLO5是FLO1的同源異型基因，位于Ⅷ號染色體上，其編碼產(chǎn)物與Flo1的氨基酸序列相似性為96%，F(xiàn)LO5含有與FLO1相同的重復(fù)單元B和C，但重復(fù)單元 A中重復(fù)序列的個數(shù)比FLO1少了 10個，重復(fù)單元D的重復(fù)序列僅剩1個完整拷貝[7]；FLO9位于染色體Ⅰ的左臂，其編碼產(chǎn)物與Flo1的氨基酸序列相似性為 94%，F(xiàn)LO9也含有與FLO1相同的重復(fù)單元B和C，但重復(fù)單元A中重復(fù)序列的個數(shù)比FLO1少了5個，重復(fù)單元D中重復(fù)序列比FLO1少了1個完整拷貝[7]；FLO10位于染色體Ⅺ上，其編碼產(chǎn)物與 Flo1的氨基酸序列相似性為58%，基因內(nèi)有兩個拷貝的重復(fù)序列與FLO1中重復(fù)單元C的重復(fù)序列類似，另有兩類重復(fù)序列，分別是78 bp的A1重復(fù)6次和105 bp的A2重復(fù)4次，并且存在間隔排列，它們與FLO1中的重復(fù)序列沒有明顯的同源性[7]；位于染色體Ⅸ上的FLO11與上述基因間有很大的差異，其編碼產(chǎn)物與 Flo1的氨基酸序列相似性僅為37%，重復(fù)序列占ORF的21.12%，可分為5種類型，其中30 bp的重復(fù)序列A3重復(fù)了6次，45 bp的重復(fù)序列A4重復(fù)了 26次，36 bp的重復(fù)序列A5重復(fù)了18次，135 bp的重復(fù)序列C1重復(fù)了4次，99 bp的重復(fù)序列C2重復(fù)了2次[8-9]；Lg-FLO1位于染色體Ⅷ上，ORF為3 903 bp，其編碼產(chǎn)物與Flo1的氨基酸序列相似性約為60%，重復(fù)序列占ORF的44.09%，其中與FLO1重復(fù)單元A中135 bp重復(fù)序列同源的有8個拷貝，與重復(fù)單元C中重復(fù)序列同源的有2個拷貝，并保留了FLO1中重復(fù)單元D中的一個重復(fù)序列拷貝，此外還有Lg-FLO1特有的重復(fù)序列，即4個拷貝的42 bp重復(fù)序列A6，14個拷貝的48 bp重復(fù)序列A7和4個拷貝的21 bp的重復(fù)序列C3[5,10]。

2 基因內(nèi)重復(fù)序列變化引發(fā)的絮凝多樣性

重復(fù)序列是基因內(nèi)高度活躍的成分，通過驅(qū)動基因內(nèi)或基因間的滑移和重組，改變基因內(nèi)重復(fù)序列的數(shù)量或排列方式，從而影響絮凝蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞表現(xiàn)出絮凝多樣性。

2.1 絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列與酵母細(xì)胞絮凝能力

圖1 絮凝蛋白模塊式結(jié)構(gòu) (a)[3]及絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列 (b) 示意圖Fig. 1 Schematic representation of the module structure of Flo protein (a)[3] and the intragenic repeats in FLO genes(b). Different color represents a kind of repetitive sequence, and the corresponding amino acid sequences are indicated.Analysis were conducted on the base of nucleotide sequences of FLO1 (AY949848), FLO5 (NM001179342), FLO9(NM001178205), FLO10 (NM001179892), FLO11 (NM001179541) and Lg-FLO1 (AB288349) deposited in GenBank.A, B, C and D in Figure B indicate the different repeat units in FLO.

完整絮凝基因FLO1及其重復(fù)序列數(shù)量發(fā)生變化的衍生基因FLO1M和FLO1S在非絮凝酵母中表達(dá)，帶有完整絮凝基因FLO1的酵母細(xì)胞絮凝能力明顯高于帶有衍生基因的酵母細(xì)胞，其中重復(fù)序列數(shù)量最少的FLO1S基因賦予酵母細(xì)胞的絮凝能力最低[11-13]，提示絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列數(shù)量與酵母細(xì)胞絮凝能力間有密切關(guān)系。Verstrepen等在美國哈佛大學(xué)和比利時魯汶大學(xué)對FLO1基因內(nèi)重復(fù)序列和細(xì)胞絮凝表型之間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，他們通過基于URA3基因插入和敲除的5-氟乳清酸 (FOA) 抗性篩選模型獲得基因內(nèi)部重復(fù)序列個數(shù)發(fā)生改變的大小在2.9～5.4 kb的FLO1的衍生基因，這些基因間的差異主要是FLO1內(nèi)重復(fù)單元A中重復(fù)序列數(shù)量的多少；對這些基因的表達(dá)分析證實重復(fù)序列的個數(shù)與細(xì)胞之間相互聚集產(chǎn)生絮凝的能力呈正相關(guān)，基因內(nèi)重復(fù)序列越長，細(xì)胞所表現(xiàn)的絮凝能力越強(qiáng)[14]。2012年He等報道了一個來源于絮凝型工業(yè)酵母 SPSC01的FLO1類基因，即FLO1SPSC，該基因含有一個8 049 bp的ORF，編碼2 682個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；序列比較發(fā)現(xiàn)該基因與完整FLO1相比，除了一些位點發(fā)生變異外，最明顯的差異是重復(fù)單元A中重復(fù)序列的個數(shù)多了 25個；該基因在非絮凝型酵母中表達(dá)可以產(chǎn)生非常強(qiáng)的絮凝[15]。但由于沒有不同基因表達(dá)的比較分析，因此重復(fù)序列的增多是否導(dǎo)致更強(qiáng)的絮凝還不清楚。對FLO10和FLO11的研究發(fā)現(xiàn)，基因內(nèi)重復(fù)序列數(shù)量增加，增強(qiáng)了細(xì)胞表面疏水性，從而提高了細(xì)胞之間相互聚集的能力[16-17]。上述重復(fù)序列數(shù)量的變化主要發(fā)生在重復(fù)單元A區(qū)域，對FLO1中其他重復(fù)單元內(nèi)重復(fù)序列進(jìn)行不同程度的缺失，發(fā)現(xiàn)重復(fù)單元B、C、D分別全部缺失或部分缺失對細(xì)胞絮凝能力幾乎沒有影響[18-19]。因此，重復(fù)單元A所編碼的多肽是絮凝蛋白中參與跨越細(xì)胞壁功能的主要結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域重復(fù)序列數(shù)量發(fā)生變化將影響絮凝蛋白跨越細(xì)胞壁在細(xì)胞表面的展現(xiàn)，同時影響細(xì)胞表面疏水性，從而影響鄰近細(xì)胞之間的相互作用，使細(xì)胞表現(xiàn)出絮凝強(qiáng)度的差異。絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列的數(shù)量與細(xì)胞絮凝能力成正相關(guān)，但不是簡單的線性關(guān)系[20]。

2.2 重復(fù)序列與絮凝蛋白和游離糖相互作用特異性和敏感性

存在于細(xì)胞表面的絮凝蛋白通過其氨基端與鄰近細(xì)胞表面甘露糖鏈相互識別和作用使細(xì)胞發(fā)生聚集，產(chǎn)生絮凝表型；因此當(dāng)環(huán)境中存在游離的糖分子時，可以通過與絮凝蛋白的競爭性識別和結(jié)合抑制細(xì)胞間的聚集和絮凝的發(fā)生。據(jù)此可以將絮凝表型劃分為絮凝型 (Flo1-type) 和新絮凝型 (NewFlo-type)。通常認(rèn)為不同糖對絮凝是否表現(xiàn)出抑制作用只與絮凝蛋白的氨基端糖結(jié)合域有關(guān)，只有此功能域發(fā)生突變才會導(dǎo)致糖識別和作用的特異性和敏感性發(fā)生變化[5,17,21]。但本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LO1重復(fù)單元A內(nèi)重復(fù)序列發(fā)生部分缺失或合并重復(fù)單元 B、C、D缺失導(dǎo)致酵母細(xì)胞絮凝表型發(fā)生轉(zhuǎn)換[22-23]。我們從具有新絮凝 (NewFlo-type) 表型的釀酒酵母基因組文庫中克隆到兩個基因FLONS和FLONL，序列分析發(fā)現(xiàn)，絮凝蛋白 FloNS的1～302、303～615和616～1 132氨基酸序列與絮凝蛋白Flo1的1～302、527～839和1 021～1 537氨基酸序列完全相同，F(xiàn)lo1的兩個內(nèi)部重復(fù)序列303～526和840～1 020在FloNS中缺失；FLONS缺失的兩段序列均位于FLO1基因重復(fù)單元 A中。推測FLONS可能是由于FLO1基因在染色體復(fù)制時基因內(nèi)重復(fù)序列發(fā)生重組或重排產(chǎn)生的。而FLONL不但缺失了上述兩個重復(fù)區(qū)域，還缺失了FLO1基因重復(fù)單元 B、C、D及其他部分3端編碼序列，推測序列缺失發(fā)生在文庫構(gòu)建過程中由基因內(nèi)重復(fù)序列引發(fā)的重組事件。FLONS和FLONL在非絮凝酵母細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生的絮凝表型受多種糖 (甘露糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖) 的抑制，是典型的新絮凝 (NewFlo-type)表型；更為有意思的是，國際上公認(rèn)半乳糖對任何絮凝表型都沒有抑制作用，但我們的研究表明FLONS或FLONL表達(dá)產(chǎn)生的絮凝受到半乳糖的抑制[22-24]。這是國內(nèi)外首次報道FLO1基因內(nèi)部重復(fù)序列數(shù)量變化不僅可以改變酵母細(xì)胞的絮凝能力，還可以改變絮凝蛋白與不同糖識別和相互作用的特異性。對FLO1中重復(fù)單元B、C、D的研究，發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)單元分別發(fā)生缺失，不改變絮凝蛋白與游離糖分子相互作用的特異性，但降低了對甘露糖的敏感性[18-19]?？梢娦跄騼?nèi)重復(fù)序列數(shù)量變化不僅影響細(xì)胞絮凝能力，同時對絮凝蛋白和糖分子之間相互識別和作用的特異性和敏感性也有重要的調(diào)控作用。這為通過培養(yǎng)液中糖種類和濃度變化對絮凝的發(fā)生進(jìn)行時序控制奠定了理論基礎(chǔ)。

2.3 絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列與絮凝的酸堿適應(yīng)性

絮凝的發(fā)生除依賴于其遺傳學(xué)基礎(chǔ)外，還受到各種環(huán)境條件 (如溫度、pH、金屬離子種類和濃度、營養(yǎng)條件、細(xì)胞大小和世代等) 的影響。其中環(huán)境酸堿變化可以通過影響絮凝基因表達(dá)、細(xì)胞表面靜電荷水平、絮凝蛋白活性等3個方面對酵母菌絮凝產(chǎn)生影響[1,25]。FLO1基因重復(fù)單元A中重復(fù)序列發(fā)生缺失，雖然使酵母細(xì)胞在最適pH條件下的絮凝能力降低，但使酵母細(xì)胞在偏酸或偏堿環(huán)境中的絮凝能力明顯高于含有完整FLO1基因的酵母細(xì)胞，提高了絮凝對環(huán)境酸堿變化的適應(yīng)性[20,23]；FLONS與FLO1相比缺失了重復(fù)單元A中兩個重復(fù)序列區(qū)域，在最適pH條件下，帶有FLONS基因的酵母菌株絮凝能力是帶有FLO1基因酵母菌絮凝能力的77.6%，但前者絮凝能力在pH 2.0～7.0范圍內(nèi)沒有明顯變化，而后者在pH 2.0、pH 7.0條件下的絮凝能力分別比在pH 4.0時降低了10%和30%[23]。絮凝基因FLO1a3與FLO1相比重復(fù)單元A中重復(fù)序列減少了12個拷貝，在最適pH條件下，帶有FLO1a3基因的酵母菌絮凝能力是帶有FLO1基因酵母菌絮凝能力的70.5%；與最適pH條件下相比，前者在pH 2.0和pH 9.0條件下的絮凝能力分別降低了47.8%和37.3%，而后者在pH 2.0、pH 9.0條件下的絮凝能力分別降低了58.9%和91.6%[20]。FLO1基因內(nèi)重復(fù)單元B、C、D中重復(fù)序列發(fā)生缺失同樣提高了酵母菌絮凝對環(huán)境酸堿變化的適應(yīng)性[18-19]；對重復(fù)單元C內(nèi)重復(fù)序列的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)FLO1基因內(nèi)銜接重復(fù)序列發(fā)生缺失增強(qiáng)了絮凝蛋白在環(huán)境酸堿變化中的構(gòu)象穩(wěn)定性，從而提高了酵母菌絮凝特性對環(huán)境酸堿變化的適應(yīng)性[19]。這種基于重復(fù)序列變化產(chǎn)生的廣泛的環(huán)境酸堿適應(yīng)性對滿足工業(yè)發(fā)酵過程和環(huán)境修復(fù)中的多樣化需要具有重要意義。

3 絮凝基因的遺傳不穩(wěn)定性

Sato等在對底層發(fā)酵釀酒酵母的研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞絮凝能力表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，而細(xì)胞的其他生理生化特性卻沒有明顯變化[13]。絮凝特性的這種遺傳不穩(wěn)定性是由絮凝基因家族的不穩(wěn)定性引起的，該家族基因有著非常顯著的分化能力[26-27]，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因一方面是由于絮凝基因家族 (除FLO11外)都位于染色體末端[10,28]，因而有大量的重排事件發(fā)生，從而造成基因的重復(fù)、缺失以及轉(zhuǎn)位[29]；另一方面是由于絮凝家族基因內(nèi)部普遍存在大量的重復(fù)序列[14,30]，這些重復(fù)序列作為基因組中非?；钴S的成分，導(dǎo)致了絮凝基因內(nèi)部和基因之間的大量重組，而且重復(fù)序列區(qū)域的突變頻率是常規(guī)突變的100倍以上[14]。因此絮凝特性存在遺傳不穩(wěn)定的嚴(yán)重問題。

目前對重復(fù)序列間如何相互作用而導(dǎo)致重組事件發(fā)生還沒有非常清楚的了解，推測重組事件主要是由于 DNA復(fù)制過程中FLO基因內(nèi)或基因間重復(fù)序列發(fā)生不對等的配對和交換的結(jié)果[3,14]。Verstrepen等利用URA3-FOA抗性篩選系統(tǒng)，分析比較了FLO1內(nèi)銜接重復(fù)序列在DNA修復(fù)和重組突變體中發(fā)生重組的頻率，發(fā)現(xiàn)重組事件的發(fā)生與由于 DNA復(fù)制障礙形成的雙鏈斷裂密切相關(guān)[14]。我們通過大腸桿菌和釀酒酵母雙重篩選模型分析連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中絮凝基因序列、細(xì)胞絮凝能力及遺傳穩(wěn)定性變化，并結(jié)合相關(guān)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)絮凝基因重復(fù)單元A中存在重組熱點序列，缺失上述序列使絮凝特性的遺傳穩(wěn)定性明顯提高[19,31]。

4 總結(jié)與展望

良好的絮凝特性既是酵母細(xì)胞抵抗環(huán)境脅迫的一種群體保護(hù)機(jī)制，同時為酵母菌參與的工業(yè)發(fā)酵過程提供了一種更加有效的、環(huán)境友好的、低廉的細(xì)胞分離和產(chǎn)品澄清途徑。其在燃料乙醇、啤酒釀造等產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域已有很好的研究和應(yīng)用實例[24,32-36]，同時在其他發(fā)酵工業(yè)中也凸顯出非常重要的應(yīng)用潛力[37]。近年來，利用酵母菌的絮凝特性去除工業(yè)廢水中的 Cu2+、Ni2+、Cr3+、Cr6+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子也受到極大關(guān)注[37-38]。絮凝的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，絮凝基因內(nèi)高度重復(fù)序列與絮凝蛋白結(jié)構(gòu)和功能，以及酵母菌絮凝特性有非常密切的關(guān)系，通過調(diào)控絮凝基因內(nèi)重復(fù)序列種類和數(shù)量可以實現(xiàn)對酵母菌絮凝能力、環(huán)境酸堿變化適應(yīng)性和遺傳穩(wěn)定性的相對定量控制，以及基于糖抑制特異性和敏感性的絮凝發(fā)生時序控制，從而為絮凝特性在發(fā)酵工業(yè)或環(huán)境修復(fù)過程中的可控應(yīng)用提供新的解決策略。未來通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)等方法解析重復(fù)序列對絮凝蛋白結(jié)構(gòu)及功能影響的具體機(jī)制，將為基于序列調(diào)控策略改造酵母菌絮凝特性提供更加準(zhǔn)確的遺傳修飾靶點。

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