王 雷，姜廷波，張介馳

(1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150090;2.東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040;3.黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，哈爾濱 150010)

黑龍江省作為傳統(tǒng)的林業(yè)大省，經(jīng)過多年粗放式采伐經(jīng)營，不僅造成了森林可采資源匱乏，而且致使林木優(yōu)良種質(zhì)資源和林地土壤肥力嚴(yán)重退化。黑龍江省西部“三肇”、大慶、齊齊哈爾等地土壤鹽漬化和荒漠化程度不斷加重，這種惡劣的生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。目前，在黑龍江省西部林草植被恢復(fù)過程中，林木生產(chǎn)用品種不僅數(shù)量少，而且品質(zhì)差、產(chǎn)量低、抗逆性差。因此培育出抗逆的林木新品種，是解決上述問題的關(guān)鍵。林木由于生長周期長、遺傳負(fù)荷大，許多重要性狀不僅分析困難，而且遺傳機(jī)理不明，從而造成了傳統(tǒng)的林木育種方法具有周期長、見效慢、費(fèi)時費(fèi)工和優(yōu)良性狀基因的來源具有較大的局限性等缺點(diǎn)，因此利用常規(guī)方法選育耐鹽堿、優(yōu)質(zhì)、速生的林木品種難度大，所以至今尚未培養(yǎng)出真正耐鹽的林木品種。現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及在林木遺傳育種研究中的廣泛應(yīng)用，為在較短時間內(nèi)培育出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和抗逆性強(qiáng)的林木新品種提供一條新的思路和方法。通過基因工程手段，可以得到大量的目的基因。按照中心法則遺傳信息的傳遞規(guī)律，最終影響生物體表型的是蛋白質(zhì)。如何獲悉這些基因翻譯成蛋白質(zhì)后的具體作用，就需要對它們進(jìn)行功能分析。從林木中克隆抗逆相關(guān)基因并研究這些基因的功能將為林木基因工程育種研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

小黑楊(Populus simonii×P.nigra)是小葉楊與歐洲黑楊的雜交種，1959年由中國林科院培育，現(xiàn)在在黃河流域及其以北的廣大地區(qū)均有栽植，是黑龍江省重要的防護(hù)樹種和用材樹種。小黑楊生長快，輕度耐鹽堿，材質(zhì)細(xì)密，可用于造紙、民用建筑等。小黑楊的研究早期多集中于引種與栽培［1，2］，近些年關(guān)注的熱點(diǎn)多集中于利用轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入外源基因提高小黑楊抗病性［3］、抗蟲性［4，5］和耐鹽性［6］的研究，而對小黑楊鹽應(yīng)答基因的研究卻很少。

環(huán)鋅指蛋白(ring zinc finger protein，RZF)最早由Lovering等［7］發(fā)現(xiàn)，它具有典型的C3HC4保守序列，保守區(qū)由40～60個氨基酸組成，富含半胱氨酸和組氨酸，可結(jié)合兩個鋅原子。由于此蛋白的性質(zhì)不穩(wěn)定，容易聚合，對其功能的研究尚不深入，初步研究表明，此蛋白可與其他蛋白相互作用，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或蛋白質(zhì)泛素化降解［8，9］。迄今人們已在水稻［10］和巴西橡膠樹［11］中克隆了 C3HC4型環(huán)鋅指蛋白基因。Zeba等［12］報(bào)道，大多非生物脅迫因素均可誘導(dǎo)甜椒環(huán)鋅指蛋白基因的表達(dá)，將甜椒中的C3HC4型環(huán)鋅指蛋白基因?qū)霟煵莺螅D(zhuǎn)基因植株的生長量明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。Schumann等［13］的研究表明，擬南芥中的一種C3HC4型環(huán)鋅指蛋白［14］在光呼吸的過程中也起作用。

本研究利用RACE技術(shù)克隆小黑楊環(huán)鋅指蛋白(Populus simonii× P.nigra ring zinc finger protein，PsnRZF)基因的全長cDNA，進(jìn)一步研究該基因在根、莖、葉中的表達(dá)以及NaCl脅迫過程中的表達(dá)變化，將小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因構(gòu)建于植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草，通過對鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草表型及生理指標(biāo)的檢測，分析該基因的功能。本研究不僅為環(huán)鋅指蛋白基因功能的深入研究提供依據(jù)和參考，也為小黑楊基因工程育種研究奠定基礎(chǔ)。林木基因工程新品種對于提高我省西部干旱地區(qū)的林木覆蓋率，改善當(dāng)?shù)貒?yán)酷的生態(tài)環(huán)境，將產(chǎn)生不可估量的生態(tài)效益。林木基因工程新品種一旦進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，不僅具有廣闊的市場推廣前景，也必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)、社會及環(huán)境效益。

1 材料與方法

將從溫室中取材的同一無性系小黑楊(Populus simonii×P.nigra)枝條進(jìn)行水培，于人工氣候室中培養(yǎng)，晝/夜溫度為26℃/22℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度175μmol/(m2·s)，相對濕度約75%。生長40 d左右，長出新的根和葉片，將其分成兩組，一組作為對照于正常條件下培養(yǎng)，另一組用200 mmol/L NaCl進(jìn)行脅迫處理，分別在脅迫開始時(第0 天)和脅迫后的第1、2、4、6、8 天中取小黑楊的根、莖、葉，每組重復(fù)3次，用蒸餾水清洗，拭干后置于液氮中，于-70℃中保存?zhèn)溆谩煵萜贩N為SR-1(Nicotiana tabacum L.cv.Petit Havana SR-1)。

用SDS法［14］分別提取小黑楊根、莖、葉中的RNA，用SYBR Premix ExTaq試劑盒(購于大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行實(shí)時定量 PCR(Real-time PCR)［15，16］。以脅迫后第2天的小黑楊葉片RNA為模板，根據(jù)PsnRZF基因的序列信息(GW672596)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行5’/3’克隆，方法見5’/3’RACE Kit，2nd Generation(Roche)。將 PsnRZF 基因連接到植物表達(dá)載體pROKⅡ35S啟動子后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化［17］，對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行RT-PCR的檢測，分別檢測非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因煙草在正常生長和NaCl脅迫狀態(tài)下的 POD活性、SOD活性、MDA含量［18］，使用SPAD-502葉綠素儀測定樣本葉綠素相對含量的變化情況。所得數(shù)據(jù)利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析 Duncan 檢驗(yàn)［19］。

2 結(jié)果與討論

2.1 小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因全長cDNA的克隆

采用5’/3’RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法擴(kuò)增PsnRZF基因的5’/3’端，3’RACE得到一條630 bp的條帶(圖1)，5’RACE得到一條404 bp的片段(圖2)，經(jīng)電子拼接獲得帶有PolyA的全長cDNA序列為1 061 bp。采用NCBI中的ORF程序顯示5’非翻譯區(qū)為184 bp，3’非翻譯區(qū)為82 bp，開放讀碼框?yàn)?95 bp，編碼264個氨基酸。用NCBI的保守功能區(qū)域(conserved domains)分析程序預(yù)測基因的保守區(qū)，結(jié)果表明該基因編碼產(chǎn)物屬于環(huán)鋅指蛋白超家族，保守區(qū)位于第58～104氨基酸。

圖1 PsnRZF 3’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 3’RACE product of PsnRZF cDNA M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1為3’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 NaCl脅迫下小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因的表達(dá)分析

為研究小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因在鹽脅迫下的應(yīng)答，用Real-time PCR檢測NaCl脅迫前后PsnRZF基因在根、莖、葉中表達(dá)的結(jié)果(圖3)表明:在正常生長狀態(tài)下，PsnRZF基因在根、莖、葉中均表達(dá)。在NaCl脅迫條件下，PsnRZF基因表達(dá)量在根、莖、葉中均升高，此基因在根中表達(dá)量變化并不顯著。隨著脅迫時間的延長，PsnRZF基因在莖和葉中的表達(dá)量逐漸升高。此基因在葉中表達(dá)量的變化最為明顯，在脅迫后第2天和第4天顯著高于對照(P＜0.05)，在脅迫后的第6天，此基因的相對表達(dá)量達(dá)到最高，極顯著地高于對照(P＜0.01)。脅迫后的第4、6、8天，PsnRZF基因在莖中的相對表達(dá)量顯著高于對照(P＜0.05)。

圖2 PsnRZF 5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 5’RACE product of PsnRZF cDNA M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn);1為5’RACE擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 NaCl脅迫下小黑楊PsnRZF基因在根莖葉中的表達(dá)Fig.3 The expression levels of PsnRZF gene in roots，stems and leaves under NaCl stress

小黑楊PsnRZF基因在不同器官中表達(dá)量變化存在差異，這可能是由于此基因編碼的環(huán)鋅指蛋白參與的很多生理反應(yīng)主要是在葉中進(jìn)行，如光呼吸，所以PsnRZF基因在葉中的表達(dá)量變化最為明顯。隨著NaCl脅迫時間的延長，PsnRZF基因的表達(dá)量也隨之升高，說明鹽脅迫影響了該基因的表達(dá)，PsnRZF可能在鹽脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。植物在逆境脅迫時，體內(nèi)會積累很多物質(zhì)，如信號分子ABA，有研究表明環(huán)鋅指蛋白可能參與ABA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。隨著鹽脅迫時間的延長，體內(nèi)信號分子不斷積累，PsnRZF基因表達(dá)量升高，作為信號受體的PsnRZF數(shù)目增多，PsnRZF作為信號受體與信號分子互作，從而調(diào)控鹽應(yīng)答基因的表達(dá)。但小黑楊環(huán)鋅指蛋白(PsnRZF)與哪類信號分子互作，以及這種互作調(diào)控哪些基因的表達(dá)都有待進(jìn)一步研究。

2.3 小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因功能驗(yàn)證

本研究利用正向遺傳學(xué)的方法來研究小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因(PsnRZF)的功能。將PsnRZF基因連接到植物表達(dá)載體pROKⅡ35S啟動子后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，使其在煙草中過量表達(dá)，檢測過量表達(dá)的PsnRZF基因?qū)χ参锂a(chǎn)生的影響，從而確定其功能。對轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測已經(jīng)證明，PsnRZF基因已經(jīng)導(dǎo)入煙草中，并在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)(圖4)。通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草并無差別。正常生長條件下，多數(shù)轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量低于非轉(zhuǎn)基因煙草(圖5)，轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量卻高于非轉(zhuǎn)基因煙草(圖6)。這說明在正常生長條件下，PsnRZF基因的過量表達(dá)對植物體是有害的，這種傷害可能與氧化脅迫相關(guān)，導(dǎo)致膜脂的過氧化，因此轉(zhuǎn)基因植株MDA含量高于非轉(zhuǎn)基因植株。在鹽脅迫下，非轉(zhuǎn)基因植株SOD和POD活性迅速增強(qiáng)(圖7、8)，有效清除活性氧。但非轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量仍高于正常條件下的水平，說明鹽脅迫對非轉(zhuǎn)基因煙草膜脂造成了傷害;而鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量卻低于正常條件下的水平，這說明環(huán)鋅指蛋白對鹽脅迫下的膜脂氧化有一定的抑制作用或參與膜脂過氧化后的修復(fù)。鹽脅迫后，小黑楊環(huán)鋅指蛋白發(fā)揮了與正常生長條件下不同的功能。環(huán)鋅指蛋白具有E3泛素連接酶的活性，在正常生長與鹽脅迫下，環(huán)鋅指蛋白可能對不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行泛素化修飾，從而執(zhí)行不同功能［20］。

圖4 轉(zhuǎn)PsnRZF基因煙草的RT-PCR檢測Fig.4 RT-PCR detection of PsnRZF gene in transgenic tobacco

3 結(jié)論

克隆獲得小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因cDNA序列，全長1 061bp，屬于環(huán)鋅指蛋白超家族基因。PsnRZF基因在不同器官中表達(dá)量變化存在差異，在葉中的表達(dá)量最高，其次為莖，在根中的表達(dá)量最低;在脅迫條件下，莖和葉中表達(dá)量呈現(xiàn)先逐漸升高后降低的變化趨勢，而在根中，該基因表達(dá)量的變化不顯著。在正常生長條件下，PsnRZF基因的過量表達(dá)可導(dǎo)致植物膜脂氧化程度增強(qiáng);但在鹽脅迫條件下，PsnRZF基因的過量表達(dá)可以緩解膜脂的過氧化作用。

圖5 NaCl脅迫對煙草葉綠素相對含量的影響Fig.5 Chlorophyll relative content of transgenic NaCl stress

圖6 NaCl脅迫對煙草MDA含量的影響Fig.6 MDA content of transgenic tobacco under tobacco under NaCl stress

圖7 NaCl脅迫對煙草SOD活性的影響Fig.7 SOD activity of transgenic tobacco NaCl stress

4 展望

本研究分析了PsnRZF基因的過量表達(dá)對植物的影響，在未來的工作中可以利用RNA干擾的方法使小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因沉默，觀察小黑楊的變化，從而進(jìn)一步研究小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因的功能，并且可以采用酵母雙雜交的方法確定不同生長條件下環(huán)鋅指蛋白與何種蛋白發(fā)生互作。本研究中，植物表達(dá)載體上的啟動子為35S啟動子，該通用型啟動子有一定的局限性，在未來的育種研究中，建議將35S啟動子替換成誘導(dǎo)型啟動子，這樣可以更好地調(diào)控PsnRZF基因表達(dá)，提高小黑楊的抗逆性。

圖8 NaCl脅迫對煙草POD活性的影響Fig.8 POD activity of transgenic tobacco under under NaCl stress

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