趙 新 王 永* 蘭青闊 賀長征 陳 銳 李歐靜 劉 娜朱 珠 郭永澤

（1天津市農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所，天津 300381；2天津市種子管理站，天津 300061）

大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕為十字花科蕓薹屬蔬菜，作為我國主要的蔬菜作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要位置。大白菜的種植區(qū)域分布廣泛，種植數(shù)量較多，近幾年對大白菜種子純度的監(jiān)督抽查工作較為重視，種子質量的好壞直接影響到種子生產(chǎn)者、經(jīng)營者和使用者的合法權益。因此，加強大白菜種子純度的控制和檢查管理尤為重要。傳統(tǒng)的田間形態(tài)鑒定是種子純度鑒定的仲裁方法，但時間長、易受環(huán)境條件的影響，因此為適應種子純度快速鑒定的需求，室內(nèi)分子檢測技術成為近年來研究的熱點。

隨著分子生物學標記技術的發(fā)展，人們開始利用分子標記技術進行種子純度的研究，ESTSSR技術是其中的一種。EST-SSR技術又叫基于表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）的簡單重復序列（si mple sequence repeats，SSR）標記技術，與其他分子標記技術相比具有技術操作簡單、特異性較強、重復性穩(wěn)定、多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳等特點（Powell et al.，1996；忻雅 等，2006）。同時GenBank數(shù)據(jù)庫中積累了大量重要物種的EST序列，且獲取方便，無需任何費用，已經(jīng)成為發(fā)展SSR標記的重要來源，因此EST-SSR技術不僅保留了SSR標記技術的優(yōu)點，而且凸顯了其便捷、花費低、效率高的優(yōu)勢（Wim et al.，2009）；但SSR技術也存在著相對的不足，即一次試驗得到的位點較少，針對這一問題，Tommasini等（2002）發(fā)展了多重SSR分析技術，并有效地鑒定了油菜品種。

EST-SNP技術也叫基于表達序列標簽的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標記，是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是繼SSR之后的新一代分子標記技術，具有密度高、穩(wěn)定性好、分析易自動化等特性，近年來被廣泛應用于甜瓜、菜豆、甜椒等蔬菜分子輔助育種及品種鑒定研究（Carlos et al.，2009；Wim et al.，2009；Jung et al.，2010；蘭青闊 等，2012）。

本試驗以10份大白菜雜交種及其親本為試材，利用新型復合EST-SSR分子標記進行大白菜雜交種純度鑒定的研究，篩選雜交種特異譜帶為親本互補帶型的引物，建立一次試驗可獲得多位點的標記方法，快速、高通量、低成本，確保了種子純度鑒定結果的可靠性。同時基于EST序列信息，結合HRM和Pyrosequencing技術，初步探索了大白菜SNP位點的篩選、確認和檢測技術路線，旨在為建立精確、快速、高通量和高度自動化的大白菜種子純度鑒定方法提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2011年12月至2012年11月在天津市農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所遺傳育種分析實驗室進行，以10份市售大白菜雜交種（表1）為試驗材料，種子由天津科潤蔬菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 單粒種子育苗條件 本試驗通過1臺簡單的恒溫培養(yǎng)箱來模擬種子萌發(fā)外界條件，達到在最短時間內(nèi)成功育苗的效果，以提高試驗效率。具體方法如下：采用玻璃培養(yǎng)皿，以棉花、紗布墊底，用自來水將其濕潤后均勻撒入單粒種子，為持久保持種子濕潤度，在種子表面再覆蓋一層面巾紙，夜間在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜，白天采用室溫日光燈補光，48 h種子破殼率可達100%，7 d后發(fā)芽率可達100%。

表1 供試品種名稱及特征特性

1.2.2 DNA提取 選取經(jīng)48 h剛剛破殼的大白菜種子和經(jīng)7 d達到苗期的單株葉片，同時應用改良CTAB法進行DNA提取，經(jīng)1%凝膠電泳檢測，比較DNA提取質量。具體改良CTAB法如下：取單粒破殼種子或單株葉片粉碎，加入CTAB-A液（裂解緩沖液）550 μL，65 ℃水浴30 min；加入氯仿異戊醇500 μL，顛倒混勻，13 200 r·min-1離心10 min；吸取上清液500 μL，加入2倍體積CTAB-B液（沉淀緩沖液），室溫靜置30 min；13 200 r·min-1離心10 min；棄上清液，沉淀中加入350 μL CTAB-C液，回溶；加入350 μL氯仿異戊醇，顛倒混勻，13 200 r·min-1離心10 min；吸取上清液340 μL，加入0.7倍體積預冷的異戊醇，顛倒混勻，13 200 r·min-1離心10 min；棄上清液，沉淀中加入500 μL 70%乙醇清洗，13 200 r·min-1離心10 min；棄上清液，沉淀風干，加入30～40 μL TE緩沖液充分溶解后即為DNA。

1.2.3 高通量快速DNA提取方法 為適應大批量種子純度鑒定工作的需要，對種子高通量快速DN A提取方法進行比對，包括chexe-100法、堿煮法、CTAB-A液直接裂解法。3種方法都分別設置20、40、60、120 min 4個時間梯度，具體方法如下：① chexe-100法。使用電動組織研磨器將單粒種子或單株葉片破壁打碎至粉漿狀，加入50 μL chexe-100，65℃水浴，設置時間梯度；-20℃冷凍10 min，13 200 r·min-1離心3～4 min，上清液即為DNA。② 堿煮法。使用電動組織研磨器將單粒種子或單株葉片破壁打碎至粉漿狀，加入50 μL NaOH（1 mol·L-1），100 ℃煮沸，設置時間梯度；加入 25 μL Tris-HCl（1 mol·L-1，pH 8.0），100 ℃煮沸 5 min；-20℃冷凍10 min，13 200 r·min-1離心3～4 min，上清液即為DNA。③ CTAB-A液直接裂解法。使用電動組織研磨器將單粒種子或單株葉片破壁打碎至粉漿狀，加入50 μL CTAB-A液，65 ℃水浴，設置時間梯度；-20 ℃冷凍10 min，13 200 r·min-1離心3～4 min，上清液即為DNA。

1.2.4 EST-SSR引物設計與合成 利用GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）上公布的170 148條大白菜EST序列，通過CMD SSR Server（http：//www.cottonmarker.org/cgibin/cmd_ssr）在線設計30對核心引物，命名為BC1～BC30，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.5 復合EST-SSR引物篩選 以大白菜雜交種及其親本的基因組DNA為模板，分別用30對EST-SSR引物進行擴增，產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。 篩選出雜交種特異譜帶為親本互補帶型的引物，同時結合單一引物擴增結果及特異譜帶的相互位置差異，優(yōu)化組合多個引物對，篩選復合EST-SSR標記。

1.2.6 PCR擴增體系及程序 PCR擴增反應的總體積為10 μL：2×GoTaq?Master Mixes 5 μL，上游和下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，大白菜基因組DNA模板（50 ng·μL-1）1 μL，雙蒸水補足10 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，53.5 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.7 EST-SNP位點獲取 基于兩種技術路線探索EST-SNP獲取方法。方法一：分析ESTSSR引物聚丙烯凝膠電泳結果，回收親本互補條帶并測序，經(jīng)序列比對尋找SNP候選位點，設計引物，通過焦磷酸驗證，確定Baicai-9 SNP位點。方法二：通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢蕓薹屬SNP位點，設計PCR引物，對大白菜雜交種及其親本進行擴增，通過高分辨率溶解曲線分析候選SNP位點，擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，應用生物學軟件對序列進行Blast比對，對候選13 799 SNP位點設計焦磷酸引物進行驗證。

2 結果與分析

2.1 單粒種子育苗條件及提取狀態(tài)確定

從圖1和圖2可以看出，從48 h破殼的大白菜種子和經(jīng)7 d達苗期狀態(tài)的大白菜單株提取的基因組DNA均表現(xiàn)主帶清晰，整齊一致，沒有明顯降解，可用于下一步PCR擴增。

圖1 48 h破殼的大白菜基因組DNA電泳結果

圖2 經(jīng)7 d達苗期的大白菜基因組DNA電泳結果

2.2 引物及復合EST-SSR引物篩選結果

以10份大白菜雜交種及其親本為模板，對30對EST-SSR引物進行篩選，其中7對引物的雜交種帶型為雙親的互補帶型，可用于大白菜雜交種種子純度的鑒定。選取其中條帶清晰、特異性主帶位置差異明顯的3對引物，用于鑒定種子純度。對這3對引物進行優(yōu)化組合，確定了一套復合EST-SSR引物，可同時對10份大白菜雜交種進行種子純度鑒定。引物序列及可鑒定品種見表2。應用這套復合EST-SSR引物對10份大白菜雜交種進行純度鑒定的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖3所示。由表2和圖3均可得出雜交種1（秋綠75）、3（秋綠60）、5（津白56）可同時應用3對引物對其純度進行鑒定，既提高了鑒定效率，也增強了純度鑒定結果的可靠性。

表2 引物序列及可鑒定品種名稱

2.3 高通量快速DNA提取方法比較結果

3種高通量快速DNA提取方法提取大白菜津白56經(jīng)48 h破殼狀態(tài)的單粒種子和經(jīng)7 d達到苗期狀態(tài)的單株葉片基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖電泳均未見DNA條帶，但以chexe-100法提取經(jīng)7 d達到苗期狀態(tài)的單株葉片的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增可達到EST-SSR理想的鑒定效果，其他2種方法提取的DNA均未擴增出相應條帶，結果如圖4所示。且3種方法所需單株狀態(tài)均為苗期，可見種子破殼初期的狀態(tài)尚難以滿足高通量快速DNA提取的需要。

圖3 10份大白菜雜交種復合EST-SSR引物純度鑒定結果

2.4 Baicai-9 SNP位點獲取

2.4.1 SNP候選位點的獲得 應用引物BC-9擴增雙親，以回收的特征譜帶DNA為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，拼接測序結果，對雙親特異性條帶的序列進行比對，通過堿基差異尋找SNP候選位點，結果如圖5所示。

2.4.2 SNP引物設計與合成 應用焦磷酸引物設計軟件，對SNP候選位點進行引物設計，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表3。

圖4 不同提取方法提取津白56 DNA的復合EST-SSR引物擴增結果

圖5 引物BC-9擴增大白菜親本序列同源性比對結果

2.4.3 SNP位點的驗證 通過焦磷酸測序引物（正向和反向引物）對秋綠75、秋綠60、耐抽薹型春綠1號、津白56、秋綠55、津夏3號的親本及雜交種進行前期PCR擴增。PCR擴增反應的總體積為50 μL：2×GoTaq?Master Mixes 25 μL，上游和下游引物（10 μmol·L-1）各1.25 μL，基因組DNA模板（50 ng·μL-1）3 μL，雙蒸水補足 50 μL。PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53.5 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

測序單鏈的制備：將3 μL鏈親和素包被的磁珠和47 μL binding buffer混勻，然后加入到50 μL的PCR產(chǎn)物中，1 300～1 400 r·min-1室溫下振蕩混勻10～15 min；預先在PSQ Low反應板中加入40 μL含有0.3 μmol·L-1測序引物的Annealing Buffer；在Vacuum prep workstation中進行單鏈制備，備用。再根據(jù)軟件提示，在試劑艙相對應位置加入所需的底物，酶和A、C、G、T。焦磷酸測序反應堿基噴入次序（dispensation order）為C/TAGCTCTGGGA。由C-T堿基峰高與后續(xù)AGCTC堿基峰高比較可以看出，SNP分型為C/T，篩選得到的SNP位點可對6份大白菜雜交種進行純度鑒定，測序結果如圖6所示。

表3 SNP引物序列

圖6 6種大白菜雜交種SNP鑒定結果

2.5 13 799 SNP位點獲取

通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢蕓薹屬SNP位點，設計PCR引物，對大白菜雜交種及其親本進行擴增，擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，應用生物學軟件對序列進行Blast比對，對候選位點設計SNP焦磷酸引物，進行驗證，通過津夏3號驗證13 799是否為SNP位點，能否用于雜交種純度鑒定。

2.5.1 依據(jù)蕓薹屬SNP位點設計PCR引物 通過查詢CuGenDB數(shù)據(jù)庫，獲得Contig 13 799序列信息，該序列在94 bp 處具有C/T/A多態(tài)性的候選SNP位點、在96 bp 處具有C/T/G多態(tài)性的候選SNP位點、在107 處具有C/T/G多態(tài)性的候選SNP位點。使用LightScanner Primer Design software設計用于高分辨率熔解曲線技術掃描分析（HRM）的PCR引物，上游引物序列為 H13799-F：5′-TTACTTTCGCCGACACAAAC -3′，下游引物序列為 H13799-R：5′- ATGTGCTCCTATGTAACCCA-3′。

2.5.2 測序及SNP引物設計 依據(jù)HRM掃描分析結果，將候選SNP位點送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，依據(jù)Contig 13 799序列信息，使用PSQ Assay Design軟件設計一套焦磷酸測序引物，包括PCR上游引物P13799-F：Biotin-5′-CAACCATTGCTGATTAGAGTAACA-3′、下 游 引 物 P13799-R：5′-TTGATTTAGCGTTAGGGAGTCTG -3 ′ 及 測 序 引 物 P13799-Seq：5′-GCTAGTGAGACCGTTAAGAT-3′。

2.5.3 焦磷酸測序結果 依據(jù)HRM掃描分析結果，對候選SNP位點進行PCR擴增和焦磷酸測序確認。焦磷酸測序反應堿基噴入次序（dispensation order）為GC/TCTAGC，其中第1位堿基G和第5位堿基A為陰性對照。圖7為焦磷酸測序結果，由C、T堿基峰高與后續(xù)CTAGC堿基峰高比較可以看出，SNP分型為C/T，命名該SNP位點為13 799。該位點與采用2.4中回收雙親特征譜帶測序的技術路線，所獲取的津夏3號SNP位點實為大白菜品種的同一SNP分子特異性標記位點。

圖7 津夏3號SNP鑒定結果

3 結論與討論

隨著基因組數(shù)據(jù)庫的不斷完善以及分子輔助育種技術的突破性進展，使得種子真實性鑒定及純度檢測的田間形態(tài)學標記正逐步被分子標記技術所替代。與傳統(tǒng)形態(tài)學性狀鑒定相比，基于DNA水平差異的EST-SSR標記技術，具有穩(wěn)定性高、共顯性、重復性好等特點，而且開發(fā)成本相對低廉（趙新 等，2013），更重要的是其檢測不受基因表達和環(huán)境條件的影響，可以在植株生長的任何階段進行，大大提高了檢測效率，可以在育種初期及時有效地保證育種的質量，避免造成不必要的經(jīng)濟損失。

近年來，通過不斷研究大白菜基因組序列信息和SSR位點特異性分子標記，豐富了相關數(shù)據(jù)信息，但SNP位點特異性分子標記長期以來未見研究報道，在一定程度上滯后了分子標記等現(xiàn)代育種手段在大白菜育種和種子純度鑒定上的應用（魯忠富 等，2012）。本試驗基于EST序列信息，通過兩種技術路線，成功獲取到大白菜品種同一SNP分子特異性標記位點，更加確保了位點的可靠性，同時應用獲取EST-SNP位點的方法和思路，結合分子生物學基礎信息研究，通過進一步的測序、篩選，可以獲取更多的EST-SNP特異性位點，對更多的大白菜品種或其他物種進行標記和鑒定，為分子輔助遺傳育種課題組下一步工作奠定了基礎。

然而，對于種子純度鑒定，無論是田間形態(tài)學還是分子標記技術，其純度結果與檢樣量基數(shù)密切相關，為確保檢測結果的準確性，必須保證充足且科學的檢樣量基數(shù)，一般一個品種的檢測數(shù)量不得少于60株單株。因此，為適應高通量種子純度檢測的需要，本試驗對EST-SSR標記復合體系進行了篩選，根據(jù)單一引物的相互位置差異進行優(yōu)化組合，使單一引物的擴增片段處在不同片段大小的區(qū)域，避免復合標記結果的重疊性，同時對提高檢測效率的相關環(huán)節(jié)也進行了優(yōu)化。復合EST-SSR標記對10份大白菜雜交種純度鑒定具有很好的區(qū)分效果，通過一次反應最多可同時檢測到3個不同的多態(tài)性標記位點，既有效地降低了試驗成本，同時又加大了試驗結果的可靠性。通過對提高檢測效率的相關環(huán)節(jié)的摸索，確定了最佳育苗條件及DNA提取方法，對于高通量苗期單株DNA的提取可在40 min內(nèi)完成，在一定程度上有效地節(jié)省了檢測時間，降低了人力物力的消耗。

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