北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司

王麗哲 王麗麗 趙 瑜于重楠 唐慧林 劉 敏

中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 何艷玲

慶大霉素屬于常見的氨基糖苷類藥物之一，在獸醫(yī)臨床中應(yīng)用廣泛，對于奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎的治療均有很好的療效（徐亭，2005）。然而，慶大霉素對人類具有明顯的毒害作用，對腦神經(jīng)、聽覺以及腎臟的損害嚴(yán)重，隨著該藥的大量使用，其殘留檢測也漸漸被人們所重視 （李桂平等，2008）。我國及歐盟對慶大霉素的殘留有嚴(yán)格要求，在牛奶中的最大殘留限量不能高于100 μg/kg。

本研究研發(fā)了一種半定量檢測牛奶中慶大霉素的膠體金試劑盒，在傳統(tǒng)膠體金檢測的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，包含有一條控制線（C線），兩條不同限量的檢測線T1、T2（均包被目標(biāo)檢測物全抗原），用于牛奶樣品中目標(biāo)殘留物的半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 氯金酸 ，SIGMA公司；硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊、塑料背襯，均為Millipore公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器 BioJet點(diǎn)膜儀XYZ 3050，BioDot公司；數(shù)控斬切機(jī)ZQ5000，上海金標(biāo)生物技術(shù)公司；高速低溫離心機(jī)3K15，SIGMA公司；水浴鍋BT-47，YAMATO公司；恒溫培養(yǎng)箱Ic160，Sacvis公司；恒溫磁力攪拌器HJ-3，金壇市科興儀器廠；冰箱FF40，海爾公司；冷藏柜MDF-192AT，SANYO公司；渦旋振蕩器MS1 Minishaker，IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 慶大霉素偶聯(lián)抗原合成 慶大霉素屬于小分子抗原，需要與其他蛋白偶聯(lián)制備成全抗原方具有免疫原性，并需以競爭法制備膠體金試紙條。稱取40 mg慶大霉素硫酸鹽和10 mg BSA，分別溶解于1 mL的蒸餾水中，將BSA溶液逐滴加入到慶大霉素溶液中，室溫下于磁力攪拌器上攪拌2 h以上。取120 mg EDC.HCl溶于1 mL蒸餾水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室溫下繼續(xù)攪拌1 h以上，然后于4℃放置過夜。用PBS透析3 d后，分裝，-20 ℃貯存（徐亭，2005）。

1.3.2 抗體-膠體金標(biāo)記

1.3.2.1 膠體金溶液的制備 將1 g氯金酸溶于超純水配制0.01%的氯化金水溶液，取100 mL加熱至沸騰，在攪動狀態(tài)下加入1.5 mL的1%檸檬酸三鈉水溶液。繼續(xù)加熱煮沸15 min，隨后冷卻至室溫，用超純水恢復(fù)至原體積，在波長510～550 nm測定其最大吸收波長，并4℃避光保存（付云潔等，2010；鄧省亮等，2007）。

1.3.2.2 最適標(biāo)記pH的確定 取15個1.5 mL試管，分別加入1 mL制備好的膠體金溶液，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié) pH 為 3、4、5、6、7、8、9、10，后室溫放置10 min；加入濃度為0.2 mg/mL的慶大霉素抗體，每管各60 μL，混合后室溫放置30 min；觀察膠體金顏色變化，直到室溫下放置2 h仍保持紅色的為最適pH。

1.3.2.3 最低標(biāo)記蛋白量的確定 取6個1.5 mL試管，分別加入1 mL制備好的膠體金溶液；用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH為最適pH，混合后室溫放置 10 min； 分別加入 10、15、20、25、30、35 μL、0.2 mg/mL慶大霉素抗體，混合后室溫放置30 min；每管加入20 μL濃度為10%的NaCl溶液，混合后室溫放置10 min；顏色仍保持紅色的最小蛋白用量即為最小蛋白標(biāo)記量。

1.3.2.4 抗體-膠體金復(fù)合物制備 取已制備好的膠體金溶液50 mL，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)pH至最適標(biāo)記pH。攪拌中加入抗體至最適標(biāo)記蛋白量，繼續(xù)攪拌20 min，加入10%BSA水溶液直至BSA的終濃度為1%，繼續(xù)攪拌10 min；于4℃、12000 r/min離心30 min，小心棄去上清，加入 50 mL 0.01 mol/L Tris-HCl溶液 （pH 8.2，含1%BSA，簡稱TBS）再重復(fù)清洗一次，最后用5 mL 0.01 mol/L TBS將沉淀重懸，0.22 μm微孔濾膜過濾，4℃避光保存。

1.4 免疫層析膠體金試紙條的制備 方法參照許定花等（2009）中的制備方法。

1.4.1 檢測線、控制線及抗體-膠體金復(fù)合物包被濃度的確定 包被T1、T2兩條不同濃度的慶大霉素偶聯(lián)抗原在硝酸纖維素膜上，作為層析試紙條的檢測線；包被二抗（兔抗鼠抗體）在硝酸纖維素膜上作為層析試紙條的控制線，其中控制線包被在兩條檢測線上方；再包被抗體-膠體金復(fù)合物在膠體金結(jié)合墊上作為游離反應(yīng)物，通過對添加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果分析，調(diào)整兩條檢測線的包被濃度，以及抗體-膠體金復(fù)合物的包被濃度，使T1、T2兩條檢測線在檢測牛奶樣品中慶大霉素時，最終靈敏度分別為20 μg/kg和100 μg/kg。

1.4.2 膠體金試紙條各組分的組裝 依次將包被有T1、T2線和C線的硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊和吸水墊貼到背襯上，組裝成大卡；然后將大卡用斬切機(jī)切割成4 mm寬度的試紙條，用于后續(xù)實驗。

2 結(jié)果和分析

2.1 膠體金溶液的制備 所制備的膠體金顏色為紅色，透明，在510～550 nm其最大吸收值為1.149，對應(yīng)的吸收波長為528 nm（圖1）。

圖1 膠體金溶液最大吸收波長掃描圖

2.2 最適pH的確定 經(jīng)過實驗確定的最適標(biāo)記pH為8。

2.3 最低標(biāo)記蛋白量的確定 經(jīng)過實驗確定的最小蛋白用量為 25 μL，即 5 μg/mL。

2.4 免疫層析膠體金試紙條的制備 最終確定抗體-膠體金復(fù)合物用TBS以 1∶1比例稀釋后濃度最合適，將此溶液包被玻璃纖維，37℃恒溫干燥箱烘干用于制備免疫層析試紙條。確定的控制線包被濃度為0.3 mg/mL，兩條檢測線T1、T2包被濃度分別為0.1 mg/mL和0.5 mg/mL。

用組裝的免疫膠體金試紙條檢測牛奶樣品，T1、T2兩條檢測線的靈敏度可分別達(dá)到20 μg/kg和100 μg/kg（圖2）。且樣品僅需稀釋即可上樣檢測，5 min內(nèi)即可出結(jié)果，方法簡便，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。

圖2 陰性牛奶樣品添加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品 20 μg/kg 和 100 μg/kg 檢測結(jié)果

3 討論與小結(jié)

目前牛奶中慶大霉素的殘留檢測常用的方法是液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和免疫膠體金層析法。前兩種方法需要專業(yè)人員和設(shè)備，無法實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，傳統(tǒng)的免疫膠體金層析法可以實現(xiàn)樣品的現(xiàn)場操作，但只能實現(xiàn)樣品殘留的定性檢測，而無法做到半定量檢測（馬偉等，2009；齊雪琴，2006）。

本實驗通過牛奶樣品中的目標(biāo)殘留物與呈橫條狀分布于免疫層析膜上的 T1、T2線共同競爭性地與膠體金標(biāo)記抗體反應(yīng)，由免疫層析膜上T1、T2線的顯色情況來判定待檢樣品中目標(biāo)殘留物的含量范圍，當(dāng)層析膜上的T1、T2均顯色時，說明待檢測樣品中的殘留物含量低于最低檢測限；當(dāng)層析膜上T1、T2線只有一條顯色，說明待檢測樣品中殘留物的含量在最低檢測限和最高檢測限之間；當(dāng)層析膜上T1、T2線均不顯色，僅有C線顯色時，說明待檢測樣品中殘留物的含量超過了最高檢測限。該慶大霉素半定量金標(biāo)快速檢測試劑盒，最低檢測限為20 μg/kg，最高檢測限為100 μg/kg。設(shè)定的最低檢測限可以滿足企業(yè)對于優(yōu)質(zhì)奶源分級篩選的要求，最高檢測限可以滿足我國以及歐盟標(biāo)準(zhǔn)最高殘留限量要求。

由此可見，本研究所制備的免疫層析試紙條在檢測牛奶樣品時，檢測方法簡單，所需檢測時間短，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，不僅實現(xiàn)了對樣品的定性檢測，更能對樣品進(jìn)行半定量檢測，對奶制品質(zhì)量控制方面來說有重大意義。

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