盧 斌，馬 健，楊翠華，王 堅

胰島β細(xì)胞分泌功能減退是糖尿病發(fā)生的重要機制，而高血糖可進(jìn)一步破壞胰島β細(xì)胞分泌功能，造成胰島素分泌減少，引起惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)高血糖可能是通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島分泌功能下降。硫辛酸是已知抗氧化劑中效果最強的一種。硫辛酸可以減少自由基對β細(xì)胞的損害［1］，然而確切機制尚未明確。本研究通過觀察硫辛酸對db／db小鼠胰島β細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶表達(dá)的影響，探討硫辛酸改善β細(xì)胞分泌功能的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 20只8周齡清潔級健康雄性C57BL／KsJ db／db小鼠，由我院解放軍腎臟病研究所提供，體質(zhì)量為35 g～40g。按隨機數(shù)字表分為硫辛酸組（10只）和db／db對照組（10只），每日固定時間分別給予硫辛酸（山東齊都藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）60mg／kg和相同體積的安慰劑（5%阿拉伯膠）灌胃，連續(xù)給藥6周。另選取10只同周齡同窩出生的C57BL／KsJ db／m小鼠給予安慰劑灌胃作為非糖尿病對照組（db／m組）。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 生理生化指標(biāo) 每周監(jiān)測小鼠體重和空腹血糖，投藥前和投藥6周后測定空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）。血糖測定使用強生公司生產(chǎn)的One－Touch血糖儀。血清胰島素水平的測定采用小鼠胰島素ELISA試劑盒（Morinaga，Yokohama，Japan）。

1.2.2 免疫組化測定 投藥6周后，給予苯巴比妥鈉麻醉，經(jīng)心臟灌注等滲鹽水和4%多聚甲醛固定，剝離胰腺后置4%多聚甲醛4h～6h，用石蠟包埋，5μm厚度切片。ABC法檢測胰島NADPH氧化酶p22phox、gp91phox亞基的表達(dá)：切片二甲苯脫蠟，不同濃度梯度乙醇再水化后，0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，高壓熱修復(fù)抗原，10%山羊血清封閉非特異性抗原，加入一抗后4℃過夜，反應(yīng)14h加入二抗，室溫反應(yīng)30 min，辣根過氧化物酶－生物素標(biāo)記后，二氨基聯(lián)苯顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、封片。一抗：山羊抗人NADPH氧化酶p22phox、gp91phox多克隆抗體（1∶100，Santa Cruz Biotechnology，CA）。二抗：生物素化兔抗山羊IgG抗體（1∶200，Dako，Japan）。利用Axiovision 4.3軟件獲得數(shù)字照片，每只小鼠隨機選取15張胰島照片，每組分析至少45張胰島照片，以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號，采用Image Pro Plus 5.0.1系統(tǒng)測定平均光密度表示陽性物質(zhì)的相對含量，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 生理生化指標(biāo) 8周齡db／db小鼠進(jìn)入試驗時已表現(xiàn)為肥胖，血糖升高，高胰島素水平，與db／m對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而硫辛酸組與db／db對照組小鼠上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。硫辛酸組小鼠投藥后開始出現(xiàn)高血糖進(jìn)展速度的減緩，12周末時FBG、FINS水平均顯著低于db／db組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 3組小鼠的體重及生理、代謝指標(biāo)比較（±s）

表1 3組小鼠的體重及生理、代謝指標(biāo)比較（±s）

組別 體重（g）FBG（mmol／L）FINS（μg／L）8周 12周8周 12周8周 12周db／m對照組 24.4±0.3 28.7±0.5 5.4±0.7 5.7±0.8 0.8±0.1 0.8±0.2 db／db對照組 35.5±0.31） 38.1±1.31） 15.2±1.61） 25.9±2.21） 6.1±1.01） 8.7±1.11）硫辛酸組 37.4±0.31） 38.7±1.31） 14.7±1.41） 17.3±1.12） 6.6±1.11） 5.8±0.91）2）與db／m對照組比較，1）P＜0.05；與db／db對照組比較，2）P＜0.05

2.2 硫辛酸對胰島內(nèi)NADPH氧化酶表達(dá)的影響 gp91phox和p22phox陽性區(qū)域出現(xiàn)在胰島細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，半定量分析顯示，db／m對照組胰島中g(shù)p91phox的平均光密度為43.27±4.63，硫辛酸組平均光密度值為69.34±6.72，均顯著低于db／db組（95.32±7.69），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。db／m 對照組胰島中p22phox的平均光密度為152.43±4.37，硫辛酸組平均光密度值為187.81±6.25，均顯著低于db／db對照組（287.23±8.35），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

db／db小鼠是一種先天肥胖性2型糖尿病小鼠模型，一般于出生后3周～4周即可表現(xiàn)為肥胖，血糖升高等特性，是研究2型糖尿病的理想模型。本研究中8周齡db／db小鼠表現(xiàn)為高血糖、體重增加，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。

糖尿病持續(xù)高血糖狀態(tài)不僅會使活性氧簇（ROS）生成增加，也會削弱體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的作用，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，這是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一［2，3］。同時氧化應(yīng)激進(jìn)一步損害胰島細(xì)胞功能，二者形成惡性循環(huán)。及早減輕氧化應(yīng)激不僅有利于并發(fā)癥的防治，而且有利于殘存胰島細(xì)胞功能的保護(hù)。

硫辛酸是已知天然抗氧劑中效果最強的一種，它可清除體內(nèi)的多種反應(yīng)性氧自由基，而且還能還原人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，增強機體的抗氧化能力。由于胰島細(xì)胞中抗氧化酶表達(dá)相對緩慢，容易受到氧化應(yīng)激的損傷。關(guān)于硫辛酸對糖尿病胰腺的保護(hù)作用和機制已引起廣泛的關(guān)注。

本研究采用db／db小鼠模型，使用硫辛酸干預(yù)6周后血糖進(jìn)展速度減緩，6周末時血糖水平顯著低于db／db對照組。表明硫辛酸有降糖作用，結(jié)果與Balkis等［4］的報道相一致，但其具體作用機制尚不明確。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)硫辛酸減少了胰島內(nèi)NADPH氧化酶gp91phox、p22phox亞基的表達(dá)。在生理狀態(tài)下NADPH氧化酶通過其產(chǎn)物活性氧簇的負(fù)反饋調(diào)節(jié)維持較低水平，而在一系列疾病狀態(tài)，如動脈粥樣硬化和炎癥時，產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物。gp91phox和p22phox是NADPH氧化酶復(fù)合體的膜結(jié)合亞基，最近有研究證實胰島β細(xì)胞表達(dá)p22phox和gp91phox。在β細(xì)胞中葡萄糖通過蛋白激酶C依賴途徑激活NADPH氧化酶而促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，因此當(dāng)高血糖時β細(xì)胞內(nèi)高糖導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，生成大量的氧自由基，從而導(dǎo)致β細(xì)胞損傷。國外有研究表明，抗氧化劑治療能夠恢復(fù)db／db小鼠胰島素生物合成并改善葡萄糖耐量［5］。本研究利用免疫組化證實了db／db小鼠胰島細(xì)胞內(nèi)gp91phox和βp22phox表達(dá)強度遠(yuǎn)超過非糖尿病對照小鼠，硫辛酸治療顯著降低NADPH氧化酶的表達(dá)，減少了胰島局部氧化應(yīng)激的來源，從而減輕氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。

綜上所述，硫辛酸能降低db／db糖尿病小鼠血糖，其機制可能是通過降低氧化應(yīng)激的上游因子，如NADPH氧化酶的表達(dá)水平而減輕氧化應(yīng)激損傷。但胰島局部氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞損害和功能異常機制尚未完全明確，還有待進(jìn)一步研究探明。

［1］Lee BW，Kwon SJ，Chae HY，et al.Dose－related cytoprotective effect of alpha－lipoic acid on hydrogen peroxide－induced oxidative stress to pancreatic beta cells［J］.Free Radic Res，2009，43（1）：68－77.

［2］Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications［J］.Nature，2001，414（12）：813－820.

［3］項守奎，馮文煥，童國玉，等.解偶聯(lián)蛋白2基因表達(dá)與高脂飼養(yǎng)大鼠氧化應(yīng)激及胰島素抵抗的關(guān)系［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2011，24（4）：346－349.

［4］Balkis BS，Othman F，Louis SR，et al.Effect of alpha lipoic acid on oxidative stress and vascular wall of diabetic rats［J］.Rom Morphol Embryol，2009，50（1）：23－30.

［5］Kaneto H，Kajimoto Y，Miyagawa J，et al.Beneficial effects of antioxidants in diabetes：Possible protection of pancreatic beta－cells against glucose toxicity［J］.Diabetes，1999，48（12）：2398－2406.