陳燕 張春來 余廣 趙春玲

（瀘州醫(yī)學(xué)院生理教研室，四川 瀘州 646000）

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是兒童常見的睡眠問題，對(duì)兒童健康危害較大，在兒童中可引起多種并發(fā)癥［1］。國外流行病學(xué)調(diào)查顯示［2］，OSAHS在兒童中的發(fā)病率為1%～3%。兒童OSAHS與成人有很大差異，是一個(gè)獨(dú)立的臨床綜合征。目前，對(duì)兒童OSAHS的研究遠(yuǎn)沒有成人廣泛，尚有很多問題需要解決。生長相關(guān)蛋白（GAP-43）是研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)的重要標(biāo)記物之一。目前，許多利用成年大鼠制作的各種腦損傷模型都觀察到GAP-43表達(dá)的變化。然而，關(guān)于生長發(fā)育期幼鼠缺氧性腦損傷后，這一反映損傷后修復(fù)的重要指標(biāo)有何變化，尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇21 日齡的幼鼠，通過模擬OSAHS 的典型病理生理特征，建立慢性間斷性低氧（CIH）幼鼠模型，觀察CIH 幼鼠在生長發(fā)育的不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮層GAP-43表達(dá)的變化，以探討這些變化與神經(jīng)元損傷修復(fù)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性21日齡Stragu-Dawley幼鼠60只，體質(zhì)量50±5 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（川）2004-065）。隨機(jī)分為對(duì)照組和慢性間斷性低氧組（CIH 組），每組30只，每組又分為2，4，6w3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只幼鼠。

1.2 方法

1.2.1 CIH 幼鼠模型復(fù)制

參照楊宇［3］等的方法制作CIH 幼鼠模型。將CIH 組幼鼠每日置于自制的缺氧艙內(nèi)，艙內(nèi)放入大量堿石灰和硅膠以吸收二氧化碳和水蒸氣，艙壁留有小縫隙與艙外相通，使艙內(nèi)氣壓與大氣壓平衡。實(shí)驗(yàn)期間，每天9∶00a.m.～5∶00p.m.向箱內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂团懦龌旌峡諝?，每次循環(huán)6min，通過HBO-2B型控氧儀（浙江建德梅城電化分析儀器廠）監(jiān)測缺氧艙內(nèi)的氧濃度以程控輸氣和排氣裝置，使每一次循環(huán)缺氧艙內(nèi)最低氧濃度為8%，然后排除低氧氣體同時(shí)吸入空氣，使氧濃度逐漸恢復(fù)到21%。缺氧艙內(nèi)二氧化碳濃度始終＜3%，溫度保持22±2℃，連續(xù)缺氧直至取材。缺氧期間，大鼠攝食、飲水正常。對(duì)照組置于相同的缺氧艙內(nèi)，通入空氣，余處理同CIH 組。

1.2.2 標(biāo)本制備

每組各時(shí)間點(diǎn)大鼠停止處理后，乙醚麻醉，用4%多聚甲醛灌注固定后取腦。在視交叉后緣、大腦腳與橋腦交界處把腦冠狀切為3塊，置于4%多聚甲醛中后固定4h以上，將固定好的腦組織進(jìn)行常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。

1.2.3 GAP-43免疫組織化學(xué)染色

石蠟連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行GAP-43 多克隆抗體的免疫組織化學(xué)標(biāo)記，步驟如下：加入3%H2O2室溫孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；抗原微波修復(fù)；加入正常山羊血清37℃孵育30min，甩去多余液；滴加兔多克隆抗體GAP-43 50μL（1∶200），4 ℃過夜；滴加即用型二步法非生物素檢測試劑盒中聚合物輔助劑50μL（1∶1）；滴加即用型二步法非生物素檢測試劑盒中的試劑2；DAB顯色5～10min，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明、封固。陰性對(duì)照用PBS液代替一抗，其余處理相同。

1.2.4 GAP-43半定量分析

GAP-43的標(biāo)記強(qiáng)度用光密度（Optical density，OD）值表示。應(yīng)用Nikon ECLIPSE 88i顯微攝影系統(tǒng)及Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定大鼠大腦皮層GAP-43的吸光度值。各組每一只大鼠腦切片的大腦皮層隨機(jī)選取3個(gè)400×視野，分別測定其中陽性染色的OD 值，求其平均值，作為該大鼠大腦皮層的OD 值。同時(shí)，測定同一張切片上視束的吸光度值作為背景，GAP-43的吸光度值減去背景的吸光度值得到矯正吸光度值，即GAP-43免疫反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)際吸光度值。用COD 值進(jìn)行比較分析，以避免非特異性染色所造成的誤差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件完成統(tǒng)計(jì)處理分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示，組內(nèi)前后時(shí)間點(diǎn)的比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的比較采用t檢驗(yàn)（Independent-samples t test），P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

GAP-43免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀沉淀，主要分布于大腦皮層神經(jīng)元胞漿中。組間對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，CIH組各時(shí)間點(diǎn)GAP-43的COD 值均高于對(duì)照組，差異具有顯著性（P＜0.05）。對(duì)照組內(nèi)前后時(shí)間點(diǎn)比較，隨著時(shí)間增加，GAP-43的COD值逐漸降低；與對(duì)照2周組比較，對(duì)照4周組和對(duì)照6周組GAP-43的COD值明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；而對(duì)照4周組與對(duì)照6周組比較，GAP-43的COD值差異無顯著性（P＞0.05）。CIH 組內(nèi)前后時(shí)間點(diǎn)比較，CIH6周組GAP-43的COD值較CIH2 周組和CIH4 周明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；而CIH2周組與CIH4周比較，GAP-43的COD 值差異無顯著性（P＞0.05），見表1和圖1。

表1 對(duì)照組和CIH 組各時(shí)間點(diǎn)大腦皮層GAP-43的COD 值（，n＝10）

表1 對(duì)照組和CIH 組各時(shí)間點(diǎn)大腦皮層GAP-43的COD 值（，n＝10）

注：與對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；與對(duì)照2 周組比較，b P＜0.05；與CIH6周組比較，cP＜0.05。

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）可發(fā)生在嬰兒期至青春期任何年齡階段的兒童，2～5 歲為發(fā)病高峰期［2］。大鼠出生后第20～22日齡是大鼠的斷奶期，研究表明［4］，這與人類認(rèn)知發(fā)育的幼兒期相當(dāng)。一般將3月～12月齡大鼠稱為成年大鼠，3月齡以前稱為發(fā)育早期大鼠［5］。故本實(shí)驗(yàn)選擇21日齡SD 幼鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將CIH 時(shí)間設(shè)定在幼鼠發(fā)育早期，從而觀察CIH 對(duì)發(fā)育早期幼鼠大腦皮層GAP-43表達(dá)有何影響。

圖1 對(duì)照組和CIH 組各時(shí)間點(diǎn)大腦皮層GAP-43的陽性表達(dá)（×400）

生長相關(guān)蛋白（Growth associated protein-43，GAP-43）是神經(jīng)元特異性蛋白，主要存在于分化定性并開始軸突生長的神經(jīng)元中，在腦功能活躍區(qū)（如：大腦皮質(zhì)、海馬）表達(dá)量很高。研究表明［6-9］，在神經(jīng)系統(tǒng)的初期發(fā)育階段中，GAP-43在神經(jīng)元胞漿中的含量較高；隨著腦的發(fā)育成熟，GAP-43的表達(dá)逐漸降低；當(dāng)出現(xiàn)腦損傷時(shí)，其表達(dá)又會(huì)增高。因而將GAP-43 視為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)的重要標(biāo)記物之一［10］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在生長發(fā)育的各時(shí)間點(diǎn)，CIH 幼鼠大腦皮層神經(jīng)元GAP-43表達(dá)均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，并且表達(dá)高峰持續(xù)時(shí)間較長（4w），這與其他學(xué)者利用成年大鼠制作的各種腦損傷模型中觀察到GAP-43出現(xiàn)短暫增高（3～14d）不同［9，11］，說明發(fā)育早期大鼠腦損傷后，腦組織自我修復(fù)非?；钴S，提示缺氧性腦損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)啟動(dòng)保護(hù)機(jī)制并修復(fù)受損的神經(jīng)元，通過GAP-43的不斷增加促進(jìn)突觸的不斷生長是神經(jīng)進(jìn)行修復(fù)的重要方式之一。

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