應(yīng)曉蘭 葛力瑜 郝海濱 楊超波 曾文君 申屠楊萍 袁琳波

（1.溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學(xué)院機能中心，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)學(xué)院生理教研室，浙江 溫州 325035）

鐵是人體最豐富和必要的微量元素，體內(nèi)的鐵按其功能可分為必需與非必需兩種。必需鐵占體內(nèi)鐵總量的70%，存在于血紅蛋白、肌紅蛋白、血紅素酶類、輔助因子和運輸鐵中；非必需鐵則作為體內(nèi)的儲備鐵，主要以鐵蛋白和含鐵血黃素的形式存在于肝、脾和骨髓等器官組織中。鐵由于其獨特的化學(xué)反應(yīng)活性，在維持細胞和機體正常代謝過程中起著至關(guān)重要的作用，如氧的輸送、線粒體的氧化反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)和DNA 合成等［1-3］。

Hepcidin為最近發(fā)現(xiàn)的一種富含半胱氨酸的抗菌多肽。已有研究通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究得到其調(diào)控機體鐵代謝平衡的直接證據(jù)［4］。由此，學(xué)者們認為hepcidin很可能就是長期以來人們一直在尋找的存在于小腸、肝臟、骨髓和巨噬細胞之間的可溶性信號物質(zhì)。它可能通過調(diào)節(jié)DMT1、Fpn1等鐵轉(zhuǎn)運蛋白的表達，抑制十二指腸對鐵的吸收及巨噬細胞鐵的釋放［5］。目前，國內(nèi)外均罕見hepecidin信號對腦衰老作用機制的報道。本研究旨在探討脈絡(luò)叢hepcidin與腦鐵代謝和腦衰老之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑

右旋糖酐鐵注射液（河南省海天藥業(yè)有限公司，批號：010708），轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）和總鐵結(jié)合力（Total ironbinding capacity，TIBC）測定試劑盒、ROS檢測試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）。

1.2 動物及分組

63只5-6周齡體重為16-20g的清潔級昆明小鼠，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK （滬）2003-0003）。小鼠按體重隨機分為7 組，每組9 只。將右旋糖酐鐵注射液配成3 個濃度梯度：2 mg·ml-1、1 mg·ml-1、0.5mg·ml-1；空白對照組隔日大腿肌肉注射0.1 ml生理鹽水，鐵負荷組隔日大腿肌肉注射不同濃度的右旋糖酐鐵注射液0.1ml，hepcidin組先側(cè)腦室注射5μg hepcidin，再注射不同濃度的右旋糖酐鐵注射液0.1ml，連續(xù)8w，各組動物分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食。實驗室溫度21-25℃，相對濕度40-60%。

1.3 血液指標測定

采用鼠尾刺血法分別在鐵負荷的第2、4、6和8w取血，血液在cell-Dyn1700型血細胞計數(shù)儀上測定血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）含量；血清鐵（Fe）含量采用AU2700全自動生化儀測定；血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，Tf）含量和總鐵結(jié)合力（Total iron-binding capacity，TIBC）的測定嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 腦組織中鐵及ROS含量測定

鐵負荷及hepcidin 注射8w 后，各組小鼠進行水合氯醛麻醉，并迅速斷頭取腦，分離大腦皮層、小腦、海馬、紋狀體、中腦和腦干，分別稱重后于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∩鲜鼋M織分別以60℃硝酸（按1∶10稀釋）消化48～72h，取100μl消化后組織加2%硝酸1 ml，采用原子吸收光譜法（Atomic absorption spectrophotometry，AAS）測各部分腦組織中鐵的含量。ROS含量檢測嚴格按照ROS試劑盒進行。

1.5 Morris水迷宮

Morris水迷宮實驗中，保持迷宮外參照物、室內(nèi)亮度和實驗者所處位置固定不變，保持實驗室內(nèi)安靜。（1）定位航行實驗：實驗前將小鼠置于站臺上適應(yīng)20s，然后將小鼠隨機從不同象限面壁置入池內(nèi)，小鼠登上站臺5s后終止記錄，最長記錄時間為60s。若小鼠在60s內(nèi)不能上臺，引導(dǎo)其登上站臺適應(yīng)10s，最后將小鼠擦干放入鼠籠。如此將小鼠置入游泳池，3次為1組，定位航行訓(xùn)練需要完成5組，計平均值。分別測量6組小鼠平均逃逸時間，以評價小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，分別在鐵負荷的第2、4、6和8周重復(fù)上述步驟。（2）空間探索實驗：定位航行1d后撤除水面下的站臺，然后將小鼠隨機從不同象限內(nèi)壁置入水池5次，每次記錄小鼠在60s內(nèi)的游泳軌跡并進行分析；同時分別測量小鼠在靶象限內(nèi)的活動時間，以評判大鼠的空間記憶能力。在第2、4、6和8周重復(fù)上述步驟。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS14.0軟件進行分析，水迷宮數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)雙因素方差分析，其余數(shù)據(jù)間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05被認為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同組小鼠血液Hb、血清Fe、Tf含量、TIBC含量測定

與對照組比較，鐵負荷小鼠血紅蛋白量、血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量升高，且呈時間和劑量依賴性（P＜0.05），而血清Tf含量和TIBC降低（P＜0.05）。Hepcidin組血紅蛋白量、血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量較鐵負荷組降低，血清Tf含量和TIBC較鐵負荷組升高，見表1。

2.2 腦組織中鐵含量

8周末，取小鼠右側(cè)半球大腦、小腦、中腦、腦干、海馬和紋狀體組織，并行鐵含量測定，結(jié)果顯示，小腦、中腦、海馬和紋狀體中鐵含量明顯增加，而hepcidin 明顯抑制鐵的表達（P＜0.05），見表2。

2.3 腦組織ROS含量

ROS含量檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，鐵負荷小鼠腦組織ROS含量增加（P＜0.05），Hepcidin組較鐵負荷組有明顯抑制作用，且呈時間和劑量依賴性，見表2。

2.4 Morris水迷宮

定位航行實驗結(jié)果顯示2mg鐵負荷第8w 小鼠平均逃逸時間較空白對照組明顯增加（P＜0.01）；空間探索實驗結(jié)果顯示，2mg鐵負荷8w 小鼠靶象限活動時間較空白對照組明顯增加，Hepcidin組較鐵負荷組時間明顯縮短，見表3。

表1 第8周小鼠血液中Hb、血清Fe、Tf、TIBC含量（ ）

表1 第8周小鼠血液中Hb、血清Fe、Tf、TIBC含量（ ）

注：與對照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與鐵負荷組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表2 第8周小鼠腦組織中鐵和ROS含量（ ）

表2 第8周小鼠腦組織中鐵和ROS含量（ ）

注：與對照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與鐵負荷組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3 討論

鐵過負荷病因可分為遺傳學(xué)和獲得性的兩類。主要的遺傳性疾病是遺傳性血色病，還有難治性貧血，如重型海洋性貧血，遺傳性鐵粒幼細胞性貧血。獲得性疾病見于一些難治性貧血，再障需輸血（可致鐵過負荷），長期攝入鐵劑。隨著鐵攝入或輸血增多，過量的鐵最終超過含鐵血黃素沉著癥的范圍，造成組織明顯損害。本實驗通過肌注鐵劑形成不同鐵負荷動物模型，通過血清鐵、血紅蛋白、腦鐵等指標的檢測發(fā)現(xiàn)小腦，中腦和紋狀體中鐵和他主要的儲存形式鐵蛋白含量過度，同時由本實驗可見，鐵過負荷加速記憶力下降，空間定位能力下降等。因此推測鐵過負荷對小鼠小腦，中腦和紋狀體造成明顯毒性損害。

表3 第8周小鼠運動能力比較（ ）

表3 第8周小鼠運動能力比較（ ）

注：與對照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與鐵負荷組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

通過對鐵負荷小鼠腦組織ROS水平檢測發(fā)現(xiàn)ROS含量增加，且呈時間和劑量依賴性。ROS可通過細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死。機體內(nèi)的自由基通過其濃度調(diào)節(jié)著機體細胞的生死平衡。由此我們推測，鐵通過影響氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生作用［6］。

Hepcidin可調(diào)節(jié)小腸鐵代謝過程，但hepcidin信號分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有無表達？在腦的哪些區(qū)域有表達？如有表達，其具體的作用途徑和作用機制又是如何？這些問題目前尚不清楚。在前期實驗研究中發(fā)現(xiàn)，hepcidin信號分子在腦的廣泛區(qū)域（包括大腦皮質(zhì)、海馬、間腦、小腦、中腦、腦橋和紋狀體）也有高度表達，而且隨著動物年齡的增加，大腦皮質(zhì)、紋狀體和海馬hepcidin mRNA 表達顯著增加［7-8］。通過提取大鼠脈絡(luò)叢上皮細胞總mRNA 發(fā)現(xiàn)，hepcidin mRNA 表達也很高。Hepcidin在腦的廣泛區(qū)域有表達，說明其對腦鐵代謝是有調(diào)控作用的，但hepcidin調(diào)控腦鐵代謝的具體作用途徑和作用機制如何？在本實驗中，我們采用側(cè)腦室注射hepcidin預(yù)處理后進行鐵負荷，發(fā)現(xiàn)可大大減少腦鐵的沉積和減緩運動能力的遲緩現(xiàn)象，證明hepcidin可調(diào)控腦鐵代謝，在某種程度上可延緩腦衰老。這些問題的解決將為腦鐵代謝和腦衰老治療的研究打開一個新的廣闊的領(lǐng)域。今后的研究中我們將從細胞水平進一步研究hepcidin調(diào)控的神經(jīng)細胞鐵代謝過程及其機制。

1 郭佩，陳偉斌，張潔.小腸鐵釋放機制及相關(guān)疾病研究進展［J］.生命科學(xué)，2008，20（4）：651-656.

2 D′Anna MC，Veuthey TV，Roque ME.Immunolocalization of ferroportin in healthy and anemic mice［J］.J Histochem Cytochem，2009，57（1）：9-16.

3 Feder JN.The hereditary hemochromatosis gene（HFE）：a MHC class I-like gene that functions in the regulation of iron homeostasis［J］.Immunol Res，1999，20（2）：175-185.

4 宋寧，王俊，姜宏.亞鐵氧化酶Hephaestin的研究進展［J］.生理科學(xué)進展，2007，38（4）：336-338.

5 Finberg KE.Regulation of systemic iron homeostasis［J］.Curr Opin Hematol，2013，20（3）：208-214.

6 Bhattacharyya S，Pal PB，Sil PC.A 35kD Phyllanthus niruri protein modulates iron mediated oxidative impairment to hepatocytes via the inhibition of ERKs，p38 MAPKs and activation of PI3k／Akt pathway［J］.Food Chem Toxicol，2013，19（56）：119-130.

7 Wang SM，F(xiàn)u LJ，Duan XL.Role of hepcidin in murine brain iron metabolism［J］.Cell Mol Life Sci，2010，67（1）：123-133.

8 付麗娟，段相林，于鵬.鐵調(diào)素在小鼠腦內(nèi)的表達及其對膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白1和二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1表達的影響［J］.解剖學(xué)報，2007，38（3）：253-258.