任美萍 劉明華 李蓉 李萬平△

1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥物與功能性食品研究中心，四川 瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 瀘州 646000）

肝纖維化是所有慢性肝病進(jìn)展成肝硬化的共同病理基礎(chǔ)與必經(jīng)階段。肝纖維化的主要特征是肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cells，HSCs）的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的過度沉積［1］。而HSCs又是產(chǎn)生ECM 最重要的細(xì)胞，肝臟遇到致病因子侵襲時(shí)，靜息的HSCs被激活分化為肌成纖維樣HSCs，分泌膠原和多種細(xì)胞因子，引起肝ECM 合成增加，降解減少，造成肝內(nèi)ECM 不斷積聚，最后導(dǎo)致肝纖維化甚至肝硬化［2-3］。抑制HSCs的增殖和誘導(dǎo)其凋亡是治療慢性肝損傷和肝纖維化的重要策略。有研究顯示維拉帕米和丹參或尼群地平聯(lián)合使用，可預(yù)防CCl4／乙醇對大鼠肝功能的損傷，降低肝纖維化程度［4-5］，但維拉帕米對體外培養(yǎng)的HSCs的作用報(bào)道甚少。本研究初步觀察了維拉帕米對體外培養(yǎng)的HSCs增殖、凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

肝星狀細(xì)胞株HSCs引自瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院傳染與免疫實(shí)驗(yàn)室，采用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基pH 7.2～7.4的完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑

鹽酸維拉帕米片：規(guī)格：每片40mg，天津市中央藥業(yè)有限公司，批號： 090101；DMEM 高糖培養(yǎng)基：賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號：NUB0146；胰蛋白酶：美國Sigma公司；胎牛血清：天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所；4%多聚甲醛固定液：博士德生物工程有限公司，批號：20 081106；AnnexinV-FITC 試劑 盒：Beckman coulter公 司；SABC 試劑 盒 和DAB顯色劑由武漢博士德公司提供；蘇木精染液、伊紅染液、二甲苯等由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供。

1.1.3 儀器

酶標(biāo)分析儀：北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM-9602；流式細(xì)胞儀：BECKMAN COULTER 公司；倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司，型號：CKX41；CO2培養(yǎng)箱：日本Sanyo公司，型號：MCO-15A。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測維拉帕米對肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用

取對數(shù)生長期的HSCs細(xì)胞，調(diào)整為適當(dāng)濃度后接種于96孔培養(yǎng)板，每孔90μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24h貼壁后加藥。維拉帕米采用DMEM 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度后加入96孔板，每孔10μL，使其終濃度分別為0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mol·L-1，每個濃度均設(shè)4個復(fù)孔，陰性對照為等體積培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后每孔加入CCK8 10μL 培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450nm 波長下檢測各孔吸光度A 值，按下列公式計(jì)算抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=［1-（A給藥組-A空白孔）／（A陰性對照組-A空白孔）］×100%。LOGIT 法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.2 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，0.25%胰酶制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×108· L-1，每孔450μL 加入鋪有蓋玻片的24 孔板，培養(yǎng)24h待其貼壁。每孔加藥50μL，維拉帕米終濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mol· L-1，陰性組加等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，常規(guī)HE 染色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.3 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC／PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

將終濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mol·L-1的維拉帕米作用后的HSCs細(xì)胞收集于離心管，經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌一次后將細(xì)胞懸浮于100μL 的4℃PBS中，每管加Annexin V-FITC 5μL、PI 2.5μL，輕輕震蕩混勻，置冰上避光染色10min，每管加400μL 1×Buffer，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 免疫組化SABC法檢測Bax表達(dá)的影響

取對數(shù)生長期的HSCs細(xì)胞制成密度為5×107· L-1的細(xì)胞懸液，每孔450μL加入預(yù)先鋪有蓋玻片的24孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24h待其貼壁。每孔加藥50μL，維拉帕米終濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mol· L-1，陰性組加等體積培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，4%多聚甲醛固定后，采用SABC 法行免疫組化染色，中性樹膠封片，晾干。顯微鏡下觀察，每組隨機(jī)采取8個視野拍照，結(jié)果用Image-Pro plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，檢測其陽性物質(zhì)的平均光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析（組間比較用SNK 法），以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測維拉帕米對肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用

維拉帕米可抑制HSCs的增殖，隨濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，其IC50值為0.15±0.01 mol· L-1。濃度-抑制率曲線，見圖1。

圖1 維拉帕米對肝星狀細(xì)胞增殖的濃度抑制率曲線（n＝4）

2.2 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化

HE染色可見維拉帕米組出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞體積變小，胞漿減少，核固縮呈藍(lán)黑色，細(xì)胞貼壁差等改變，而陰性對照組細(xì)胞大小均一，胞漿豐富均勻，細(xì)胞核規(guī)則，核內(nèi)染色均一呈淡藍(lán)色，貼壁良好。

2.3 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC／PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

0.02 ～0.10mol·L-1的維拉帕米均可誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞的凋亡，凋亡率分別為（7.41±0.95）%、（10.06±0.62）%、（13.38±0.61）%、（17.98±0.65）%、（25.11%±1.33）%，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 維拉帕米誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞的凋亡率（，n＝3）

表1 維拉帕米誘導(dǎo)HSCs細(xì)胞的凋亡率（，n＝3）

注：與陰性對照組比較，aP＜0.05。

2.4 免疫組化SABC法檢測Bax表達(dá)的影響

不同濃度的維拉帕米作用48h后HSCs細(xì)胞Bax的表達(dá)不同程度增強(qiáng)，平均光密度值增加，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

HSCs活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵，而增殖是HSCs活化的重要特征之一。因此，抑制HSCs的增殖、誘導(dǎo)其凋亡是防治肝纖維化的策略之一［6］。細(xì)胞凋亡是組織細(xì)胞在正常發(fā)育過程中或在病理?xiàng)l件下的一種主動死亡形式，受細(xì)胞內(nèi)基因的精確調(diào)控。Bax為促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［7］。Bax可直接結(jié)合到線粒體膜上，改變膜的通透性，引起細(xì)胞色素C釋放入胞漿，激活Caspases家族，最終引起凋亡［8］。

表2 維拉帕米對HSCs細(xì)胞Bax表達(dá)免疫組化染色平均光密度（，n＝8）

表2 維拉帕米對HSCs細(xì)胞Bax表達(dá)免疫組化染色平均光密度（，n＝8）

注：與陰性對照組比較，aP＜0.05。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+是胞內(nèi)重要的第二信使，在細(xì)胞的功能活動中起著重要的作用。維拉帕米是L型鈣通道阻滯劑，能減少細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流。HSCs細(xì)胞上存在L型鈣通道，維拉帕米通過降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+，引起細(xì)胞內(nèi)鈣平衡紊亂，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示維拉帕米可抑制 HSCs 的增殖，且呈劑量依賴性。0.02～0.10mol·L-1的維拉帕米均可誘導(dǎo)HSCs 細(xì)胞的凋亡，且藥物濃度增加，凋亡率增加，其機(jī)制可能是增強(qiáng)Bax的表達(dá)而誘導(dǎo)凋亡。維拉帕米可抑HSCs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，有利于肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。Ca2+的變化可能是誘導(dǎo)HSCs凋亡的關(guān)鍵信號，但凋亡的發(fā)生是否也有其他信號系統(tǒng)的參與，維拉帕米影響B(tài)ax表達(dá)的確切機(jī)制等相關(guān)問題均有待進(jìn)一步深入研究。

1 史紅陽，許君望，任曉俠.木黃酮對肝星狀細(xì)胞增殖及脂質(zhì)過氧化的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（11）：2066-2069.

2 諶輝，劉文琪.姜黃素對日本血吸蟲病小鼠肝纖維化的影響［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（119）：1679-1682.

3 楊悅杰，黃芬.肝星狀細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在肝纖維化形成中的作用［J］.世界華人消化雜志，2007，15（27）：2885-2890.

4 郭晏同，趙景明，宋磊，等.羅格列酮抑制體外大鼠肝星狀細(xì)胞活化［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28（11）：1129-1133.

5 王青山，李亮成.維拉帕米和尼群地平對大鼠肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（4）：307-308.

6 李霞，李亮成.丹參與維拉帕米對大鼠肝纖維化？肝硬化防治作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34（1）：18-21.

7 胡泰洪，黃利華，楊玲，等.NHE-1與肝星狀細(xì)胞增殖的關(guān)系及姜黃色對其的影響［J］.世界華人消化雜志，2009，17（18）：1860-1863.

8 Paradiso A，Simone G，Lena MD，et al.Expression of apoptosis-related markers and clinical outcome in patients with advanced colorectal cancer［J］.？Br J Cancer，2001，84（5）：651-658.

9 Lucken-Ardjomande S，Martinou JC.Regulation of Bcl-2proteins and of the permeability of the outer mitochondrial membrane［J］.C R Biol，2005，328（7）：616-631.