劉 倩， 陳龍龍， 張祖艷， 李云華， 謝天培*

(1.上海滬豐生物科技有限公司，上海 200433;2.上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，上海 201203)

馬兜鈴酸 (aristolochic acid)為硝基菲類化合物，主要存在于馬兜鈴屬和細辛屬植物中。這兩屬植物在中藥中應(yīng)用廣泛。近年來，大量文獻報道了馬兜鈴酸的腎毒性及致癌致突變作用，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視［1-4］。但含馬兜鈴酸的中藥近年來在某些地區(qū)臨床上仍然大量使用［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸-DNA加合物的形成是馬兜鈴酸致癌及致突變的重要原因［7-9］，可能也參與了馬兜鈴酸腎病的發(fā)病過程［10］。Chen等［11］通過在臺灣進行的以馬兜鈴酸-DNA加合物和TP53突變譜為生物標志物的分子流行病學(xué)調(diào)查認為馬兜鈴酸暴露是導(dǎo)致上尿路上皮癌發(fā)生的重要原因。馬兜鈴酸-DNA加合物現(xiàn)已被用作檢測馬兜鈴酸中毒的生物標記物。馬兜鈴酸-DNA加合物對于深入研究馬兜鈴酸的致癌及致突變性具有重要作用。對于臨床疾病的防治工作具有重要意義。

馬兜鈴酸-DNA加合物在體內(nèi)含有量極微，體外制備反應(yīng)產(chǎn)率低，純化困難［12］。馬兜鈴酸-DNA加合物的檢測方法有32P-后標記法及質(zhì)譜法等。32P-后標記法步驟較繁瑣，不能提供加合物結(jié)構(gòu)信息，穩(wěn)定性差，不同實驗室檢測結(jié)果差異很大。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS)既能夠檢測加合物，還能提供結(jié)構(gòu)信息，已被用于馬兜鈴酸-DNA加合物分析中［12-14］。Yun 等［15］指出 UPLC-ESI/MS 法是一種靈敏度高，特異性強，穩(wěn)健的分析方法，可以替代現(xiàn)行的對人體組織中DNA加合物進行生物監(jiān)測的32P后標記技術(shù)。馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ是馬兜鈴酸類化合物的主要毒性成分。本研究通過體外合成馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物，優(yōu)化反應(yīng)條件，UPLC-ESI/MS法對馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物進行分析研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相-G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;渦旋振蕩器 (Vortex-5，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (HZQ-X100，太倉華美);離心機 (TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠);超聲波清洗儀(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 馬兜鈴酸Ⅰ (上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號:191/120416);脫氧鳥苷 (dG)、脫氧腺苷 (dA)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、N，N-二甲基甲酰胺、鋅粉均購于美國 sigma公司;cleanert C18固相萃取柱;甲醇、乙酸為色譜純;水為超純水。

2 試驗方法

2.1 馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物的合成 取1 mg馬兜鈴酸Ⅰ，用50 μL N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)溶解，超聲促溶，加入1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的脫氧鳥苷 (dG)/脫氧腺苷 (dA)磷酸鉀緩沖液及10 mg鋅粉，渦旋混勻，于37℃ 恒溫振蕩16 h［10］，反應(yīng)產(chǎn)物離心 (12 000g×10 min)以除去未反應(yīng)的鋅粉。其反應(yīng)過程見圖1。反應(yīng)后上層清液過固相萃取柱，上樣后以2 mL水淋洗 (棄去)，1 mL甲醇洗脫，洗脫液過0.45 μm微孔濾膜，LCMS分析。兩個反應(yīng)均設(shè)兩個陰性對照組，即分別不添加dG/dA，同法操作。

圖1 馬兜鈴酸-DNA加合物生成過程Fig.1 Synthesis pathway of aristolochic acid-DNA adducts

2.2 不同pH值緩沖液對馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物的影響

2.2.1 不同pH值磷酸鉀緩沖液的配制 稱取磷酸二氫鉀，倒入燒杯中，加入超純水溶解，移入量瓶中，定容至刻度，用50 mmol/L的磷酸氫二鉀調(diào)整pH值分別為6.4、5.8、5.2，即可。

2.2.2 馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物合成 按2.1頂方法。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax Extend C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm);流動相為0.2%乙酸-乙腈 (70∶30);體積流量0.4 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 (ESI)，正離子掃描;根據(jù)需要分別采用全掃描、產(chǎn)物離子掃描及MRM檢測方式 (［dG-馬兜鈴酸Ⅰ:(m/z)558.4→442.6。dA-馬兜鈴酸Ⅰ:(m/z)542.8→ 426.8］;干燥氣溫度350℃;干燥氣體積流量5 L/min;霧化器壓力45psi(1psi=6.895 kPa);鞘氣溫度400℃;鞘氣體積流量11 L/min。

2.4 正交試驗 選擇dG或dA摩爾濃度倍數(shù)(A)、加入鋅粉量 (B)、時間 (C)為考察因素，每個因素設(shè)3個水平，以質(zhì)譜MRM模式下dG-馬兜鈴酸Ⅰ/dA-馬兜鈴酸Ⅰ峰面積為指標，用L9(34)正交表安排試驗。正交試驗因素水平見表1。

2.5 馬兜鈴、青木香藥材提取物與dG或dA反應(yīng)及檢測 馬兜鈴、青木香藥材分別用甲醇提取3次，濃縮至干。按正交試驗優(yōu)選的方法將提取物與dG或dA反應(yīng)，LC-MS檢測。

表1 正交試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2.6 形成DNA加合物的最低馬兜鈴酸濃度檢測將不同濃度的馬兜鈴酸按正交試驗優(yōu)選的方法與dG/dA反應(yīng)，LC-MS檢測，確定能夠檢測到加合物的最低馬兜鈴酸濃度。

3 結(jié)果

3.1 dG-馬兜鈴酸Ⅰ、dA-馬兜鈴酸Ⅰ的質(zhì)譜行為在正離子模式下，馬兜鈴酸Ⅰ-dG、馬兜鈴酸Ⅰ-dA全掃描一級質(zhì)譜的準分子離子分別為m/z558.9、542.8，與 ［M+H］+吻合。陰性對照組中未檢測到相應(yīng)加合物。

在馬兜鈴酸Ⅰ與dA的反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)兩個m/z為542.8的質(zhì)譜峰，在0.2%乙酸-乙腈(70∶25)條件下，保留時間分別為0.977 min、3.448 min(馬兜鈴酸Ⅰ-dAI、馬兜鈴酸Ⅰ-dAⅡ)。對其進行二級質(zhì)譜掃描，在10、20、30、40 ev的碰撞能量 (CE)下，其質(zhì)譜行為相似 (結(jié)果見圖2-a1、a2)，推測馬兜鈴酸Ⅰ與dA反應(yīng)生成了兩種不同的加合物。二級質(zhì)譜中m/z426.3的離子為［M+H］+離子從糖苷鍵處斷裂失去脫氧核糖形成。當(dāng)CE為40 ev時m/z291.4的碎片離子為馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ與dA共價鍵連接處斷裂后馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的碎片離子峰。其可能的碎裂方式見圖3-a。

圖2 dG-馬兜鈴酸Ⅰ、dA-馬兜鈴酸Ⅰ二級質(zhì)譜圖Fig.2 Product ion of dG-aristolochic acidⅠ，dA-aristolochic acidⅠ

圖3 dG-馬兜鈴酸Ⅰ、dA-馬兜鈴酸Ⅰ二級質(zhì)譜碎裂方式Fig.3 Fragmentation pattern of dG-aristolochic acidⅠand dA-aristolochic acidⅠ

對馬兜鈴酸Ⅰ與dG的反應(yīng)體系中的m/z558.9準分子離子峰進行二級質(zhì)譜掃描 (見圖2-b)，CE為20 ev時m/z442.6的碎片離子為 ［M+H］+離子從糖苷鍵處斷裂丟失脫氧核糖形成。CE為40 ev時m/z291.4的碎片離子為馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ與dA共價鍵連接處斷裂后馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的碎片離子峰。m/z397.7為準分子離子丟失脫氧核糖后丟失-NHCO-形成。m/z410.2為準分子離子丟失脫氧核糖后脫去馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ上的甲氧基形成。其可能的碎裂方式見圖3-b。

3.2 不同pH值緩沖液對馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物的影響 質(zhì)譜檢測模式:MRM。結(jié)果見表2。

表2 不同pH值條件下馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2峰面積Tab.2 Aera of aristolochic acidⅠ-dA1，aristolochic acidⅠ-dA2 under different pH conditions

由表1可見，pH值不同，馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2的相對峰面積也發(fā)生變化。當(dāng)pH為5.8時，兩種加合物的峰面積之和最大，因此確定反應(yīng)pH值為5.8。

3.3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果 見表3～6。對表3～4數(shù)據(jù)進行分析。直觀分析表明，以馬兜鈴酸Ⅰ-dG峰面積為指標，最佳條件為A3B1C3，極差分析表明，各因素的影響從大到小依次為為A、C、B。方差分析表明，三個因素對結(jié)果均無顯著性影響，綜合上述分析及經(jīng)濟成本，確定方案A3B1C3為最佳條件，即用相當(dāng)于馬兜鈴酸Ⅰ3倍量的脫氧鳥苷，10倍鋅粉，反應(yīng)時間為24 h。

表3 馬兜鈴酸Ⅰ與脫氧鳥苷加合L9(34)正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Aristolochic acidⅠ-dG L9(34)design and results of orthogonal test

表4 馬兜鈴酸Ⅰ-脫氧鳥苷峰面積方差分析Tab.4 Aera variance analysis of aristolochic acidⅠ-dG

表5 馬兜鈴酸Ⅰ與脫氧腺苷加合L9(34)正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.5 Aristolochic acidⅠ-dA L9(34)design and results of orthogonal test

表6 馬兜鈴酸Ⅰ-脫氧腺苷峰面積之和的方差分析Tab.6 Aera variance analysis of aristolochic acidⅠ-dA

對表5～6數(shù)據(jù)進行分析。直觀分析表明，以馬兜鈴酸Ⅰ-dA峰面積之和為指標，最佳條件為A3B2C1，極差分析表明，各因素的影響從大到小依次為為A、C、B。方差分析表明，A因素即脫氧腺苷的加入量對結(jié)果有顯著性影響，因此確定方案A3B2C1為最佳條件，即用相當(dāng)于馬兜鈴酸Ⅰ3倍量的脫氧腺苷，20倍鋅粉，反應(yīng)時間為16 h。

3.4 馬兜鈴、青木香藥材提取物加合物檢測 在馬兜鈴、青木香藥材提取物與dG/dA的反應(yīng)體系中分別檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dG及馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物。另外還分別檢測到m/z528.6、512.4的離子。對其進行產(chǎn)物離子掃描。結(jié)果見圖4。其質(zhì)譜行為與文獻 ［10-11］相似，推測分別為馬兜鈴酸Ⅱ-dG及馬兜鈴酸Ⅱ-dA。

3.5 最低馬兜鈴酸質(zhì)量濃度檢測 能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度為40 μg/mL，能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dG，加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度為300 μg/mL。

4 討論

在馬兜鈴酸Ⅰ與dA的反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)兩個m/z為542.8的質(zhì)譜峰，質(zhì)譜行為相同，保留時間不同，推測馬兜鈴酸Ⅰ與dA、鋅粉反應(yīng)生成兩種加合物。目前未見相關(guān)文獻報道。

用不同pH值緩沖液配制dA、dG對馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物生成情況有比較明顯的影響。而且pH值不同，生成的馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2的相對量也不同。其原因尚待進一步分析。

在反應(yīng)體系中檢測到m/z為294.0、309.9的離子。m/z294.0離子的產(chǎn)物離子為m/z279.0、251.0、221.0，m/z309.9離子的產(chǎn)物離子為m/z294.6、238.9、210.8，推測分別為反應(yīng)的兩個副產(chǎn)物:馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ及7-羥基馬兜鈴內(nèi)酰胺I的準分子離子。

馬兜鈴酸Ⅰ、Ⅱ要先被酶或鋅粉還原成馬兜鈴內(nèi)酰胺鎓離子才能與dG或dA反應(yīng)形成加合物。正交試驗選擇了可能影響反應(yīng)的3個主要因素即dG或dA濃度、加入鋅粉量、時間為考察因素，據(jù)此來優(yōu)選反應(yīng)條件。

在正交試驗中曾以馬兜鈴酸Ⅰ-dG或dA與主要副產(chǎn)物—馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ峰面積 (MRM模式)之比為指標進行考察，其結(jié)果與單純用馬兜鈴酸Ⅰ-dG或dA峰面積相比趨勢相同。

圖4 馬兜鈴酸Ⅱ-dG、馬兜鈴酸Ⅱ-dA的產(chǎn)物離子掃描圖Fig.4 Product ion of aristolochic acidⅡ-dG，aristolochic acidⅡ-dA

能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度比能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dG加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度低很多，說明前者反應(yīng)體系更易生成加合物。

按照優(yōu)選的條件將馬兜鈴、青木香藥材提取物與dG或dA加合，能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2、馬兜鈴酸Ⅰ-dG、馬兜鈴酸Ⅱ-dA、馬兜鈴酸Ⅱ-dG等加合物。目前未見相關(guān)報道。馬兜鈴酸-DNA加合物的合成及純化將在以后的工作中繼續(xù)進行。

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