吳一振，楊 洋，董娟妮，王世祥，鄭 靜，劉勤社，2，鄭曉暉，3*

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069;2.陜西省人民醫(yī)院，陜西西安 710068;3.深圳清華大學(xué)研究院，廣東深圳 518057)

蒙成藥冠心七味片由丹參、檀香、降香、山柰、肉豆蔻、廣棗和沙棘七味藥材制成［1-4］?；钛觥?qiáng)心止痛，具有調(diào)節(jié)血脂和可抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［5-6］。吳燕紅等對(duì)冠心七味片中的丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯進(jìn)行了測(cè)定［7-9］，張麗華等對(duì)水溶性成分丹參素(DSS)進(jìn)行了測(cè)定［10-11］。但對(duì)冠心七味片中的沒(méi)食子酸(GA)、原兒茶酸(PA)、原兒茶醛(PHA)的同時(shí)測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。為了更全面地控制藥物質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)冠心七味片中丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，旨在為全面評(píng)價(jià)冠心七味片質(zhì)量提供參考方法。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1100系列四元高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);Sartorius BP221S型萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司);KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 冠心七味片樣品由遼寧康博士公司生產(chǎn)，片劑的規(guī)格為0.3 g/片。丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為:110855-200504，1100831-200302，110809-200503和 110800-200506);色譜純甲醇(美國(guó)Fisher公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5μm);檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，流動(dòng)相為甲醇-0.2%甲酸水線性梯度洗脫(0 min，8%甲醇);30 min，30%甲醇;體積流量0.7 mL/min;柱溫25℃。圖1為對(duì)照品、供試品和陰性樣品色譜圖。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛對(duì)照品 1.2 mg、1.4 mg、1.6 mg和1.8 mg，分別置10 mL的量瓶中，用30%甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液，4℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的配制 取樣品，研細(xì)，精密稱取冠心七味片0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 30%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率60 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液，4℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 陰性供試品溶液的制備 按照冠心七味片生產(chǎn)工藝制備［12］，制備缺丹參、廣棗的陰性制劑，并按照供試品溶液的制備方法制備陰性供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，將其配成丹參素質(zhì)量濃度為1.25、5、12.5、25、50和120μg/mL，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為8.75、17.5、35、87.5、175和350μg/mL的系列對(duì)照品溶液。原兒茶酸質(zhì)量濃度4、8、10、25、50、125和250μg/mL，原兒茶醛質(zhì)量濃度為2.5、10、25、75、125、250和 375μg/mL的系列對(duì)照品溶液。在擬定色譜條件下測(cè)定，進(jìn)樣量為50μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為 Y=3.6504 X－17.805(r2=0.9998)、Y=26.178X －148.39(r2=1.0000)、Y=18.535X－102.42(r2=0.9996)和Y=19.529X－7.92(r2=0.9999)。結(jié)果表明，丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛分別在1.25～ 120μg/mL、8.75 ～350μg/mL、4.0 ～ 250μg/mL和2.5～375μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液50μL(丹參素 12μg/mL，沒(méi)食子酸 14μg/mL，原兒茶酸16μg/mL，原兒茶醛18μg/mL)分別連續(xù)進(jìn)樣5次，丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛峰面積的RSD值分別為1.9% 、1.2%、1.4%和1.7%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取冠心七味片樣品(批號(hào)20101204)5份，分別按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛峰面積的RSD值分別為1.3%、2.8%、2.1%和1.1%。結(jié)果表明檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液50μL(批號(hào) 20101204)，室溫下放置 0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進(jìn)樣，丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛峰面積的RSD值分別為1.6%、1.9%、1.3%和1.1%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 取已知量的冠心七味片樣品(批號(hào)20101204)0.5 g，平行6份，置50 mL量瓶中，分別加入丹參素(120μg/mL)、沒(méi)食子酸(140μg/mL)、原兒茶酸(160μg/mL)、原兒茶醛(180μg/mL)對(duì)照品溶液10 mL，用30%甲醇稀釋至刻度，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，分別測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab.1 Results of recovery tests

由表1可知，丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛的平均回收率分別為99.5%、96.3%、94.8%和97.5%。結(jié)果表明方法回收率良好。

2.10 樣品測(cè)定 按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量均為50μL，每批樣品平行測(cè)定3次，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛的量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心七味片六個(gè)批次的樣品中，丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.36 mg/片、0.73mg/片、0.20 mg/片和 0.14mg/片。與其他批號(hào)比較，批號(hào)為20081107的丹參素含有量較低，而原兒茶酸和原兒茶醛的量較高;其他批號(hào)各測(cè)定成分相對(duì)比較穩(wěn)定。

3 討論

藥物內(nèi)在的質(zhì)量與療效直接相關(guān)［13］，科學(xué)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是藥物療效的保證［14］，作為中藥和中成藥質(zhì)量常規(guī)檢測(cè)的分析技術(shù)，HPLC法極其重要［15］。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)冠心七味片的提取方法進(jìn)行了考察，比較了純水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇，75%甲醇以及100%甲醇。結(jié)果表明，30%甲醇對(duì)丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛的提取效率最高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇30%甲醇作為提取溶劑。同時(shí)對(duì)提取時(shí)間也進(jìn)行了考察，比較超聲處理20、30、40、50 min。結(jié)果表明，超聲30 min時(shí)所測(cè)定成分量基本達(dá)到最大，因此選擇對(duì)樣品超聲提取30 min。

表2 冠心七味片中有效成分的測(cè)定Tab.2 Determination of components in Guanxin Qiwei Tablets

丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛這4種成分基本在275 nm左右有最大吸收，為了同時(shí)測(cè)定這4種成分，故選擇275 nm作為吸收波長(zhǎng)。

由于丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛4種成分水溶性較大，故選用甲醇-0.2%甲酸水作為流動(dòng)相且梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)4種成分分離較好，且無(wú)干擾。

用HPLC法測(cè)定冠心七味片中丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛，結(jié)果穩(wěn)定，方法簡(jiǎn)便，為測(cè)定中成藥中丹參素、沒(méi)食子酸、原兒茶酸和原兒茶醛的量提供了一種可借鑒的方法。

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