段曉穎,周艷梅,閆艷倉,郝亞潔,劉曉龍
(河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室,河南鄭州 450000)
野菊花總黃酮口腔生物黏附片是一種具有生物黏附作用的雙層貼片,用于治療口腔潰瘍,它由具生物黏附性的載藥層和不具生物黏附性的背襯層復合而成,載藥層的主要成分是黃酮類化合物,包括蒙花苷、木犀草苷、大波斯菊苷、木犀草素、芹菜素、刺槐素等,其中以蒙花苷為主要成分[1-4]。野菊花的臨床應用十分廣泛[5-6],研究表明,野菊花主要成分總黃酮具有抗菌[7-8]、抗炎[9-11]、抗病毒[12-13]、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)[14-15]等生物活性。為更好控制該制劑的質(zhì)量,依據(jù)《中國藥典》2010年版項下有關測定方法,對野菊花中蒙花苷進行了TLC鑒別,并采用UV、HPLC法對野菊花中的總黃酮、蒙花苷進行了定量測定。
LC—10AVP高效液相色譜儀(日本島津);TU—1800PC紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);AEL—200電子天平(日本島津);Sartorius CP225D電子天平(德國賽多利斯);HK250科導臺式超聲波清洗器(上海漢克科學儀器有限公司);DZKW—C電子恒溫水浴鍋(北京科偉永興有限公司);野菊花對照藥材(批號:120995-200704中國藥品生物制品檢定所);野菊花總黃酮生物黏附片(批號為 20100917、20101017、20101019,自 制);蘆 丁 (批 號100080-200707,中國藥品生物制品檢定所);蒙花苷(批號111528-200605,中國藥品生物制品檢定所);水為超純水,甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。
2.1 供試品溶液的制備 取本品20片,研細,取約1 g,加甲醇15 mL,超聲處理30 min,放冷,濾過,濾液作為供試品溶液。
2.2 對照品溶液的制備 取蒙花苷對照品,加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作為對照品溶液。
2.3 對照藥材溶液的制備 取野菊花對照藥材0.3 g,加甲醇15 mL,超聲處理30 min,放冷,濾過,濾液作為對照藥材溶液。
2.4 薄層色譜 吸取上述3種溶液各3μL,分別點于同一聚酰胺薄膜上,以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15∶15∶6∶4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以2%三氯化鋁溶液,熱風吹干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。如圖1所示。
圖1 野菊花的薄層色譜Fig.1 TLC chromatogram of Chrysanthemi lndici Flos
3.1 總黃酮測定
3.1.1 對照品溶液的制備 稱取蘆丁對照品10 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇約30 mL,置水浴上微熱使溶解,放冷,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得每1 mL含無水蘆丁0.2 mg的對照品溶液,備用。
3.1.2 供試品溶液 取同一批野菊花總黃酮口腔生物黏附片20片,搗碎后研細,取約25 mg,精密稱定,加水超聲提取10 min,冷卻,定容于25 mL量瓶中,得供試品液,備用。
3.1.3 線性關系的考察 吸取蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置25 mL具塞試管中,各管加水至6.0 mL,加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻放置6 min,再加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加氫氧化鈉溶液10.0 mL,加水至刻度,搖勻,放置15 min,在510 nm處測吸光度,以吸光度為縱坐標,質(zhì)量濃度為橫坐標繪制濃度-吸光度標準曲線,回歸方程 A=1.07×10-2+1.10×10-2C,r=0.9991,蘆丁溶液在9.81~58.85μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。
3.1.4 精密度考察 吸取供試品溶液6份,每份5.0 mL,置25 mL具塞試管中,依標準曲線項下方法,分別在510 nm下測定吸光度。測得6次吸光度的RSD為1.02%,表明精密度良好。
3.1.5 穩(wěn)定性考察 吸取供試品供試品溶液5.0 mL,置25 mL具塞試管中,定容,依標準曲線項下方法,分別在10、20、30、40、50、60 min測定吸光度,計算RSD為1.79%,表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。
3.1.6 重復性試驗 按3.1.1項下方法制備5份供試品溶液,精密吸取供試品溶液5 mL,置25 mL具塞試管中,依標準曲線項下方法,測定,計算,RSD為2.36%,表明重復性良好。
3.1.7 回收率試驗 稱取蘆丁對照品適量,配制成質(zhì)量濃度為0.8356 mg/mL的對照品溶液,作為標準加樣貯備液。稱取已知含有量的樣品9份,每份12.5 mg,精密稱定,置25 mL量瓶中,分別精密加入質(zhì)量濃度為0.8356 mg/mL的蘆丁對照品溶液,制成高中低3種不同質(zhì)量濃度的溶液9份,各精密吸取5 mL,置25 mL具塞試管中。以標準曲線項下方法測定,計算,平均回收率為99.12%,RSD為1.95%,結果見表1。
表1 回收率試驗Tab.1 Results of recorery tests
3.1.8 樣品測定 分別稱取3批樣品各3份,每份約25 mg,加水超聲提取10 min,冷卻,定容于25 mL量瓶中,得供試品液。精密吸取供試品溶液5 mL,置25 mL具塞試管中,依標準曲線項下方法,計算,3批供試品平均含有量分別為9.21%、9.32%、9.41%。
3.2 蒙花苷測定
3.2.1 對照品溶液的制備 稱取蒙花苷對照品9.62 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 mL含蒙花苷0.1924 mg)。
3.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片,研細后,混勻,取約50 mg,稱定,置具塞錐形瓶中,加入甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)15 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜,作為供試品溶液。
3.2.3 色譜條件 Agilent XDB-C18色譜柱(5μm,4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇-水-冰醋酸(26∶23∶1);檢測波長334 nm;體積流量1 mL/min;柱溫25℃;進樣量10μL。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖2。
圖2 黏附片中蒙花苷高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of linarin(A)and sample(B)
3.2.4 線性關系的考察 吸取蒙花苷對照品溶液(0.1924mg/mL)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成對照品溶液。按上述色譜條件,分別吸取對照品溶液,注入高效液相色譜儀中,測定峰面積,以峰面積積分值為縱坐標,蒙花苷進樣量為橫坐標,繪制標準曲線?;貧w得蒙花苷線性方程為:Y=22748753X+19982,r=0.9995。結果表明蒙花苷進樣量在0.096~1.924μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。
3.2.5 精密度實驗 吸取質(zhì)量濃度為0.3848 mg/mL標準對照品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,連續(xù)進樣5次,測得蒙花苷色譜峰峰面積RSD為0.31%,表明儀器精密度良好。
3.2.6 穩(wěn)定性考察 吸取供試品溶液10μL,分別在0、1、2、4、8、12、24 h進樣,測定蒙花苷色譜峰峰面積,計算峰面積相對標準偏差RSD為0.67%,表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
3.2.7 重復性考察 稱取同一批號供試品5份,每份各約50 mg,按3.2.2項下方法配制供試品溶液,測定峰面積,計算,蒙花苷的平均含有量為3.05%,RSD為0.7%。表明重復性良好。
3.2.8 加樣回收率試驗 稱取蒙花苷對照品適量,配制成0.338 mg/mL的對照品溶液,作為標準加樣貯備液。稱取已知含有量的黏附片粉末25.0 mg,平行9份,分別加入上述標準加樣貯備液,制備成高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的9份溶液,按供試品溶液制備方法制成加樣回收液。分別吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測定峰面積,計算加樣回收率,結果見表2。
表2 蒙花苷加樣回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests
3.2.9 樣品測定 分別稱取3批供試品,按3.2.2項下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液10μL,依上法測定,計算,蒙花苷的含有量分別為3.079%、3.079%、3.077%。
4.1 近年來,生物黏附制劑發(fā)展較為迅速,野菊花總黃酮口腔生物黏附雙層片屬于該類制劑。它的特點是可持續(xù)單向釋藥,生物黏附層能較好地黏附于口腔潰瘍患處,背襯層則起到賦形作用,大大延長載藥面對潰瘍面的覆蓋和黏附時間,保護創(chuàng)面,同時還可阻斷外界因素對潰瘍面的刺激,減輕患者痛苦。該劑型使藥物僅向內(nèi)側釋放,減輕藥物不適口味,增大藥物濃度梯度,使藥物緩慢釋放和吸收,達到長效目的,發(fā)揮最佳治療作用。
4.2 通過實驗確定了本制劑中野菊花總黃酮的薄層鑒別方法,采用UV法和HPLC法分別測定總黃酮和蒙花苷的量,經(jīng)方法學考察,證明方法靈敏、專屬、快速,可作為該口腔生物黏附雙層片的質(zhì)量控制方法。
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