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        野菊花總黃酮口腔生物黏附雙層貼片質(zhì)量標準研究

        2013-11-01 03:17:50段曉穎周艷梅閆艷倉郝亞潔劉曉龍
        中成藥 2013年11期
        關鍵詞:野菊花量瓶蘆丁

        段曉穎,周艷梅,閆艷倉,郝亞潔,劉曉龍

        (河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室,河南鄭州 450000)

        野菊花總黃酮口腔生物黏附片是一種具有生物黏附作用的雙層貼片,用于治療口腔潰瘍,它由具生物黏附性的載藥層和不具生物黏附性的背襯層復合而成,載藥層的主要成分是黃酮類化合物,包括蒙花苷、木犀草苷、大波斯菊苷、木犀草素、芹菜素、刺槐素等,其中以蒙花苷為主要成分[1-4]。野菊花的臨床應用十分廣泛[5-6],研究表明,野菊花主要成分總黃酮具有抗菌[7-8]、抗炎[9-11]、抗病毒[12-13]、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)[14-15]等生物活性。為更好控制該制劑的質(zhì)量,依據(jù)《中國藥典》2010年版項下有關測定方法,對野菊花中蒙花苷進行了TLC鑒別,并采用UV、HPLC法對野菊花中的總黃酮、蒙花苷進行了定量測定。

        1 儀器與試藥

        LC—10AVP高效液相色譜儀(日本島津);TU—1800PC紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);AEL—200電子天平(日本島津);Sartorius CP225D電子天平(德國賽多利斯);HK250科導臺式超聲波清洗器(上海漢克科學儀器有限公司);DZKW—C電子恒溫水浴鍋(北京科偉永興有限公司);野菊花對照藥材(批號:120995-200704中國藥品生物制品檢定所);野菊花總黃酮生物黏附片(批號為 20100917、20101017、20101019,自 制);蘆 丁 (批 號100080-200707,中國藥品生物制品檢定所);蒙花苷(批號111528-200605,中國藥品生物制品檢定所);水為超純水,甲醇、乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

        2 定性鑒別

        2.1 供試品溶液的制備 取本品20片,研細,取約1 g,加甲醇15 mL,超聲處理30 min,放冷,濾過,濾液作為供試品溶液。

        2.2 對照品溶液的制備 取蒙花苷對照品,加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作為對照品溶液。

        2.3 對照藥材溶液的制備 取野菊花對照藥材0.3 g,加甲醇15 mL,超聲處理30 min,放冷,濾過,濾液作為對照藥材溶液。

        2.4 薄層色譜 吸取上述3種溶液各3μL,分別點于同一聚酰胺薄膜上,以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15∶15∶6∶4∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以2%三氯化鋁溶液,熱風吹干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點。如圖1所示。

        圖1 野菊花的薄層色譜Fig.1 TLC chromatogram of Chrysanthemi lndici Flos

        3 定量測定

        3.1 總黃酮測定

        3.1.1 對照品溶液的制備 稱取蘆丁對照品10 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇約30 mL,置水浴上微熱使溶解,放冷,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得每1 mL含無水蘆丁0.2 mg的對照品溶液,備用。

        3.1.2 供試品溶液 取同一批野菊花總黃酮口腔生物黏附片20片,搗碎后研細,取約25 mg,精密稱定,加水超聲提取10 min,冷卻,定容于25 mL量瓶中,得供試品液,備用。

        3.1.3 線性關系的考察 吸取蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置25 mL具塞試管中,各管加水至6.0 mL,加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL,搖勻放置6 min,再加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL,搖勻,放置6 min,加氫氧化鈉溶液10.0 mL,加水至刻度,搖勻,放置15 min,在510 nm處測吸光度,以吸光度為縱坐標,質(zhì)量濃度為橫坐標繪制濃度-吸光度標準曲線,回歸方程 A=1.07×10-2+1.10×10-2C,r=0.9991,蘆丁溶液在9.81~58.85μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

        3.1.4 精密度考察 吸取供試品溶液6份,每份5.0 mL,置25 mL具塞試管中,依標準曲線項下方法,分別在510 nm下測定吸光度。測得6次吸光度的RSD為1.02%,表明精密度良好。

        3.1.5 穩(wěn)定性考察 吸取供試品供試品溶液5.0 mL,置25 mL具塞試管中,定容,依標準曲線項下方法,分別在10、20、30、40、50、60 min測定吸光度,計算RSD為1.79%,表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

        3.1.6 重復性試驗 按3.1.1項下方法制備5份供試品溶液,精密吸取供試品溶液5 mL,置25 mL具塞試管中,依標準曲線項下方法,測定,計算,RSD為2.36%,表明重復性良好。

        3.1.7 回收率試驗 稱取蘆丁對照品適量,配制成質(zhì)量濃度為0.8356 mg/mL的對照品溶液,作為標準加樣貯備液。稱取已知含有量的樣品9份,每份12.5 mg,精密稱定,置25 mL量瓶中,分別精密加入質(zhì)量濃度為0.8356 mg/mL的蘆丁對照品溶液,制成高中低3種不同質(zhì)量濃度的溶液9份,各精密吸取5 mL,置25 mL具塞試管中。以標準曲線項下方法測定,計算,平均回收率為99.12%,RSD為1.95%,結果見表1。

        表1 回收率試驗Tab.1 Results of recorery tests

        3.1.8 樣品測定 分別稱取3批樣品各3份,每份約25 mg,加水超聲提取10 min,冷卻,定容于25 mL量瓶中,得供試品液。精密吸取供試品溶液5 mL,置25 mL具塞試管中,依標準曲線項下方法,計算,3批供試品平均含有量分別為9.21%、9.32%、9.41%。

        3.2 蒙花苷測定

        3.2.1 對照品溶液的制備 稱取蒙花苷對照品9.62 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 mL含蒙花苷0.1924 mg)。

        3.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片,研細后,混勻,取約50 mg,稱定,置具塞錐形瓶中,加入甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率50 kHz)15 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜,作為供試品溶液。

        3.2.3 色譜條件 Agilent XDB-C18色譜柱(5μm,4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇-水-冰醋酸(26∶23∶1);檢測波長334 nm;體積流量1 mL/min;柱溫25℃;進樣量10μL。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖2。

        圖2 黏附片中蒙花苷高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of linarin(A)and sample(B)

        3.2.4 線性關系的考察 吸取蒙花苷對照品溶液(0.1924mg/mL)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成對照品溶液。按上述色譜條件,分別吸取對照品溶液,注入高效液相色譜儀中,測定峰面積,以峰面積積分值為縱坐標,蒙花苷進樣量為橫坐標,繪制標準曲線?;貧w得蒙花苷線性方程為:Y=22748753X+19982,r=0.9995。結果表明蒙花苷進樣量在0.096~1.924μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系。

        3.2.5 精密度實驗 吸取質(zhì)量濃度為0.3848 mg/mL標準對照品溶液10μL,注入高效液相色譜儀,連續(xù)進樣5次,測得蒙花苷色譜峰峰面積RSD為0.31%,表明儀器精密度良好。

        3.2.6 穩(wěn)定性考察 吸取供試品溶液10μL,分別在0、1、2、4、8、12、24 h進樣,測定蒙花苷色譜峰峰面積,計算峰面積相對標準偏差RSD為0.67%,表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        3.2.7 重復性考察 稱取同一批號供試品5份,每份各約50 mg,按3.2.2項下方法配制供試品溶液,測定峰面積,計算,蒙花苷的平均含有量為3.05%,RSD為0.7%。表明重復性良好。

        3.2.8 加樣回收率試驗 稱取蒙花苷對照品適量,配制成0.338 mg/mL的對照品溶液,作為標準加樣貯備液。稱取已知含有量的黏附片粉末25.0 mg,平行9份,分別加入上述標準加樣貯備液,制備成高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的9份溶液,按供試品溶液制備方法制成加樣回收液。分別吸取對照品溶液和供試品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測定峰面積,計算加樣回收率,結果見表2。

        表2 蒙花苷加樣回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests

        3.2.9 樣品測定 分別稱取3批供試品,按3.2.2項下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液10μL,依上法測定,計算,蒙花苷的含有量分別為3.079%、3.079%、3.077%。

        4 討論

        4.1 近年來,生物黏附制劑發(fā)展較為迅速,野菊花總黃酮口腔生物黏附雙層片屬于該類制劑。它的特點是可持續(xù)單向釋藥,生物黏附層能較好地黏附于口腔潰瘍患處,背襯層則起到賦形作用,大大延長載藥面對潰瘍面的覆蓋和黏附時間,保護創(chuàng)面,同時還可阻斷外界因素對潰瘍面的刺激,減輕患者痛苦。該劑型使藥物僅向內(nèi)側釋放,減輕藥物不適口味,增大藥物濃度梯度,使藥物緩慢釋放和吸收,達到長效目的,發(fā)揮最佳治療作用。

        4.2 通過實驗確定了本制劑中野菊花總黃酮的薄層鑒別方法,采用UV法和HPLC法分別測定總黃酮和蒙花苷的量,經(jīng)方法學考察,證明方法靈敏、專屬、快速,可作為該口腔生物黏附雙層片的質(zhì)量控制方法。

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