于 艷，張立德，田 原，韓 毅，樊 暉，孫科峰*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧沈陽 110032;2.遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧沈陽 110032)

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁5味中藥按等劑量組成［1］，源于漢代名醫(yī)張仲景的《金匱要略》，具有活血，化瘀，消癥之功［2］。現(xiàn)代藥理研究其具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，能抑制膀胱癌細胞增殖［3］，可治療宮頸癌［4］，子宮肌瘤［5-6］，子宮內(nèi)膜異位癥［7］，男性精索靜脈曲張引起的不育［8］，保護腦缺血再灌注損傷［9］等。對本方中活性成分的定量測定，文獻報道多為其中的1種或2種成分的測定［10-12］，本實驗采用反相高效液相色譜波長轉換法，同時對桂枝茯苓丸中的4種成分即芍藥苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚進行測定，為該制劑的質量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國Agilent1100高效液相色譜儀，G1379A真空脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1313A自動進樣器，G1315柱恒溫箱，G1315B二極管陣列檢測器;Agilent B 0403色譜工作站;AE-240電子分析天平;KH-400DB型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 試藥 芍藥苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110736-201136、 111595-200604、 110710-200212、110708-200505，純度均為98%以上。桂枝茯苓丸為市售大蜜丸(山西萬輝制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字Z14020065，規(guī)格:6 g/丸)。乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～10 min(12% ～15%A)，10～15 min(15% ～30%A)。檢測波長為230 nm(0～10 min)，290 nm(10～30 min)。體積流量1.0 mL/min。柱溫30℃。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、肉桂酸、桂皮醛、丹皮酚對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含芍藥苷 143.25μg、肉桂酸 9.03μg、桂皮醛 7.73μg、丹皮酚25.70μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品剪碎，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲(功率400 W，頻率40 kHz)處理30 min，放冷，再稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照液的制備 按處方及工藝制備不含桂枝的樣品，再按“供試品溶液的制備”項下制備成桂枝陰性對照液。另按處方及工藝制備同時不含赤芍和牡丹皮的樣品，再按“供試品溶液的制備”項下制備成赤芍和牡丹皮陰性對照液。

2.5 測定法 分別精密吸取對照品溶液5μL、供試品溶液及陰性對照液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄液相色譜圖。由色譜圖可知，在與對照品色譜峰相應的位置上供試品具有相同保留時間的色譜峰，陰性對照液在此峰位無吸收，對本品各成分的測定無干擾，見圖1。

圖1 桂枝茯苓丸HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of Guizhi Fuling Pills

2.6 線性范圍考察 分別精密吸取混合對照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μL，注入色譜儀，記錄色譜峰面積，進樣量X(μg)與峰面積Y經(jīng)線性回歸，得回歸方程為:芍藥苷Y=1306.1 X+0.7732，r=0.9998;肉桂酸 Y=6394.5 X－3.7989，r=0.9999;桂皮醛 Y=10985.0X－5.7339，r=0.9999;丹皮酚 Y=3029.9 X－10.0610，r=0.9999。芍藥苷在0.1433～3.5813μg，肉桂酸在0.0090 ～0.2258μg，桂皮醛在0.0077 ～ 0.1933μg，丹皮酚在0.0257～0.6425μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.7 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液5μL，連續(xù)進樣6次，結果峰面積值的RSD分別為芍藥苷0.29%、肉桂酸0.21%、桂皮醛0.44%、丹皮酚0.34%，表明本儀器精密度較好。

2.8 重復性試驗 取本品(批號120110)6份，研細，分別制備成供試品溶液，按測定方法測定，結果平均質量分數(shù)分別為芍藥苷2.1941 mg/g、肉桂酸0.0271 mg/g、桂皮醛0.4821 mg/g、丹皮酚0.7654 mg/g，RSD分別為芍藥苷1.31%、肉桂酸1.98%、桂皮醛0.97%、丹皮酚1.01%，表明本方法重復性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(批號120110)，分別在0、2、4、6、8、10 h測定峰面積，結果峰面積RSD分別為芍藥苷0.18%、肉桂酸0.98%、桂皮醛1.24%、丹皮酚2.01%，表明本品溶液10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的供試品(批號120110)0.25 g，共計6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品溶液(含芍藥苷0.5450 mg/mL，肉桂酸7.5000μg/mL，桂皮醛0.1180 mg/mL，丹皮酚0.2005 mg/mL)1.0 mL，蒸干溶劑，按“供試品溶液制備”項下制備，進行測定，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery tests

2.11 樣品測定 取本品，按上述方法制備成供試品溶液，精密吸取對照品溶液5μL和供試品溶液20μL，再按本實驗選定的色譜條件測定峰面積，用外標一點法計算樣品中4種成分的量，結果見表2。

3 討論

3.1 在供試品溶液的制備過程中，本實驗對提取方法、提取溶劑和提取時間進行了考察，分別選用50%甲醇、甲醇和乙醇為提取溶劑，考察了超聲提取、加熱回流提取及索氏提取3種方法，并對超聲提取時間進行了考察，結果以本實驗所述方法為最佳供試品制備方法。

表2 樣品測定結果(，n=5，mg/丸)Tab.2 Determination results of four constituents(，n=5，mg/pill)

表2 樣品測定結果(，n=5，mg/丸)Tab.2 Determination results of four constituents(，n=5，mg/pill)

樣品批號 芍藥苷 肉桂酸 桂皮醛 丹皮酚120110 13.6458±0.3738 0.1662±0.0036 2.8974±0.0336 4.6824±0.0936120112 13.0416±0.3258 0.1776±0.0036 3.1866±0.0576 4.8966±0.1134120511 13.5372±0.3300 0.1482±0.0030 2.8284±0.0312 4.5024±0.0816120601 13.5714±0.2928 0.1542±0.0042 2.9592±0.0600 5.2260±0.1248120602 13.2348±0.3366 0.1692±0.0030 3.3084±0.0762 5.0274±0.1026

3.2 本方所含赤芍及牡丹皮兩味藥中均含有芍藥苷和丹皮酚［13-15］，在實驗過程中也曾分別制備赤芍陰性液和牡丹皮陰性液，結果兩藥互相干擾，與文獻報道一致，因此在考察本制劑的質量時以兩藥中的總芍藥苷和丹皮酚為考察指標。

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