徐秋香， 郁紅禮，2，3， 吳 皓，2，3*， 潘耀宗， 宮 樂， 趙騰斐， 尤奮強

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210029;2.江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京 210019;3.國家教育部中藥炮制規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)工藝研究中心，江蘇 南京210019;4.昆山市中醫(yī)院，江蘇 昆山 215300)

湯劑是我國臨床應(yīng)用最早、最廣的一種劑型，可適應(yīng)中醫(yī)的辨證施治、隨癥加減的原則，具有吸收快，作用強的優(yōu)點［1］。中藥療效除了與藥材的質(zhì)量、炮制方法相關(guān)外，煎煮方法尤為關(guān)鍵。正如李時珍所說:“凡服湯藥，雖品物專精，修治如法，而煎藥者魯莽造次，水火不良，火候失度，則藥亦無功”［2］;清代醫(yī)家徐靈胎:“煎藥之法最宜深講，藥之效與不效，全在于此”［3］。通過查閱大量文獻(xiàn)，同時對臨床煎煮情況進(jìn)行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)各地煎煮方法差異大。臨床醫(yī)生、藥房、湯劑煎煮等相關(guān)行業(yè)人員大多未有可靠又具事實依據(jù)的說法。針對這一現(xiàn)狀，國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項對中藥湯劑傳統(tǒng)煎煮方法進(jìn)行規(guī)范化系統(tǒng)研究，目的是制定合理的煎煮操作流程，提高湯劑質(zhì)量。

四君子湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，具益氣健脾之功，主治脾胃氣虛證，是補氣基本方［4］。據(jù)文獻(xiàn)報道四君子湯有效成分為黃酮類、皂苷類、多糖類及有機酸類等成分［5］，有學(xué)者應(yīng)用液相串聯(lián)質(zhì)譜、質(zhì)譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)對復(fù)方四君子湯進(jìn)行研究，結(jié)果表明四君子湯的水溶性成分主要來源于君藥人參和使藥甘草［6］，結(jié)合2010版《中國藥典》中人參和甘草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定指標(biāo)，選擇湯劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸為指標(biāo)性成分，并結(jié)合湯劑的相對密度和浸出物兩個整體指標(biāo)，本實驗以四君子湯為研究對象，以浸泡時間、煎煮時間、加水量及煎煮次數(shù)為考察因素［7］，采用L9(33)正交設(shè)計對四君子湯傳統(tǒng)煎煮工藝進(jìn)行多指標(biāo)綜合優(yōu)選。并比較特殊藥物人參另煎和不另煎方法對湯劑質(zhì)量的影響，研究不同煎煮器具 (砂鍋、養(yǎng)生壺、不銹鋼鍋)和煎煮火候 (先武后文、一直文火)對湯劑質(zhì)量的影響［8-9］。本方煎煮的規(guī)范化研究，將對補益類中藥湯劑煎煮，特別是貴重藥物的另煎特殊煎煮方法，提供規(guī)范化研究的借鑒。

1 材料

Waters2695高效液相色譜儀;waters2589檢測器;UNIQUE-S15超純水發(fā)生器;BP211D電子天平 (德國Sartorius公司);KQ—500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)。

人參皂苷Rg1對照品 (批號110703-201027)、人參皂苷Re對照品 (批號110754-200822)、人參皂苷Rb1對照品(批號 110704-200921)、甘草酸對照品 (批號 110731-200614)，購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈 (美國天地試劑公司，色譜純，純度≥99.9%，批號1102374)，其余試劑為分析純。

四君子湯處方:人參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g。人參 (吉林產(chǎn)，批號110710)、白術(shù) (浙江產(chǎn)，批號110306)、茯苓 (安徽產(chǎn)，批號110513)、炙甘草 (內(nèi)蒙古產(chǎn)，批號110519)四種飲片均購自南京海源中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸的測定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 Thermo Hypersil BDS色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.03%甲酸，梯度洗脫，0～14 min，19%乙腈;14～15 min，20.7%乙腈;15～28 min，20.7%乙腈;28～33 min，29%乙腈;33～47 min，41%乙腈;47～52 min，41%乙腈。體積流量為0.9 mL/min;柱溫30℃;人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1檢測波長為202 nm，甘草酸檢測波長為250 nm;進(jìn)樣體積20 μL。在此色譜條件下人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸能與雜質(zhì)完全分離，并取得較好的峰形和較高的理論塔板數(shù)，效果滿意。

2.1.2 供試溶液的制備 精密量取50 mL四君子湯藥液，置分液漏斗中，用正丁醇萃取3次，每次50 mL。合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇適量分次溶解，移置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密量取1 mL人參皂苷Rb1對照品溶液 (1.599 mg/mL)，0.5 mL人參皂苷Re對照品溶液 (1.368 mg/mL)，0.5 mL人參皂苷Rg1對照品溶液(1.522 mg/mL)，混勻即得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中人參皂苷Rb1為0.799 5 mg/mL，人參皂苷Re為0.342 mg/mL，人參皂苷 Rg1為0.380 5 mg/mL。甘草酸銨為0.822 4 mg/mL。

2.1.4 精密度試驗 取2.1.3項下的混合對照品溶液和甘草酸銨對照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，分別對上述4種物質(zhì)進(jìn)行定量測定，考察精密度，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸銨的峰面積的RSD值分別為0.61%、0.35%、0.46%、0.35%，均小于3%，說明儀器的精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 平行制備6份供試品溶液，按上述液相條件下分別對4種主要指標(biāo)性成分進(jìn)行定量測定，考察方法的重復(fù)性，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和甘草酸的峰面積的RSD值分別0.25%、0.74%、2.66%、2.57%，均符合測定要求。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 同一供試品溶液，室溫下自然放置，分別于0、2、4、8、12、24 h對4種指標(biāo)性成分進(jìn)行定量測定，考察樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷 Rb1和甘草酸的 RSD值分別為0.84%、0.62%、1.93%和0.47%，均小于3%，表明樣品中人參皂苷Rg1，人參皂苷Re，人參皂苷Rb1和甘草酸的量在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收試驗 精密量取上述已知量的藥液25 mL，共6份，分別加入一定量的對照品溶液適量，依制備供試品溶液項下制備，按上述液相色譜條件方法測定，計算加樣回收率。結(jié)果表明人參皂苷Rg1的平均回收率為100.86%，RSD為2.34%;人參皂苷Re的平均回收率為100.57%，RSD為2.95%;人參皂苷Rb1的平均回收率為97.88%，RSD為2.86%;甘草酸的平均回收率為99.25%，RSD為2.97%，表明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確。

2.2 湯劑相對密度和浸出物的測定相對密度和浸出物

2.2.1 湯劑浸出物的測定 精密量取25 mL藥液 (相當(dāng)于3.3 g原藥材的質(zhì)量)，置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h至恒定質(zhì)量，移置干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算得膏率［10］。

2.2.2 湯劑相對密度的測定 參照《中國藥典》2010年版 (一部)附錄ⅦA相對密度測定法中的比重瓶法下的(2)法測定［10］。

2.3 四君子湯傳統(tǒng)煎煮工藝影響因素的優(yōu)選

2.3.1 煎煮次數(shù)的考察 稱取6劑四君子湯，每劑共加20倍量的水，浸泡60 min，分別煎煮1次、2次、3次，每次煎煮60 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，用外標(biāo)兩點法計算，得到上述指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，結(jié)果如表1。

表1 不同煎煮次數(shù)對湯劑質(zhì)量的影響

結(jié)果顯示，煎煮2次時，湯劑中各指標(biāo)性成分較煎煮1次都明顯升高;煎煮3次時，湯劑中人參皂苷Rg1反而下降;綜合考慮加水量、煎煮時間及能源消耗等因素，選擇煎煮2次。

2.3.2 浸泡時間的考察 稱取10劑四君子湯，每劑四君子湯加20倍量的水，分別浸泡1、2、3、4、5 h，煎煮2次，每次煎煮60 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，測定結(jié)果如表2。

結(jié)果顯示，隨著浸泡時間的延長，湯劑中的主要指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度有所增加，但是到一定時間后，其增加幅度減緩。故選擇2、3、4 h作為正交設(shè)計表中“浸泡時間”項下的三水平。

表2 不同浸泡時間對湯劑質(zhì)量的影響

2.3.3 煎煮時間的考察 稱取6劑四君子湯，每劑四君子湯加20倍量水，浸泡4 h，煎煮2次，每次分別煎煮30、60、90 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，結(jié)果如表3。

表3 不同煎煮時間對湯劑質(zhì)量的影響

結(jié)果顯示，煎煮60 min時，湯劑中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的量最高。而甘草酸的量及湯劑的浸出物和相對密度隨時間延長而增加。故選擇40、60、80 min作為正交設(shè)計表中“煎煮時間”項下的三水平。

2.3.4 加水量的考察 稱取6劑四君子湯，每劑四君子湯分別加12、20、28倍量的水，浸泡4 h，煎煮2次，每次加水量分別為6、10、14倍量［10］，每次煎煮60 min，每份所得藥液均濃縮到250 mL。每份平行兩次。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，結(jié)果如表4。結(jié)果顯示，不同的加水量，湯劑中的指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度及湯劑的浸出物，相對密度不同，隨著加水量的增加，湯劑中的主要指標(biāo)性成分的質(zhì)量濃度有所增加，考慮到藥液的濃縮時間，故選擇16倍、20倍、24倍量水作為正交設(shè)計表中“加水量”項下的三個水平。

表4 不同加水量對湯劑質(zhì)量的影響

2.4 正交設(shè)計法優(yōu)選四君子湯傳統(tǒng)煎煮工藝研究 (人參與其余藥味合煎) 在確定煎煮次數(shù)為2次的基礎(chǔ)上，以浸泡時間、煎煮時間和加水量為考察因素，結(jié)合上述四君子湯煎煮工藝影響因素研究的結(jié)果，每個因素下設(shè)定三個水平，其因素水平表見表5。

表5 因素水平

2.4.1 正交試驗設(shè)計與方差分析 四君子湯質(zhì)量綜合評分方法:三種人參皂苷和甘草酸的加權(quán)系數(shù)分別為0.7和0.3;三種人參皂苷量總和評分=(三種人參皂苷量之和/三種人參皂苷量之和最大值)×0.7×100;甘草酸量評分=(甘草酸量/甘草酸量最大值)×0.3×100。綜合評分=三種人參皂苷量綜合評分+甘草酸量評分。本研究L9(33)正交實驗綜合評分結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表6 L9(33)正交試驗設(shè)計和結(jié)果

表7 四君子湯傳統(tǒng)煎煮正交工藝方差分析

直觀分析結(jié)果可知，各因素對湯劑質(zhì)量的影響程度為C＞A＞B＞D，D為誤差項，即影響湯劑質(zhì)量的主要因素依次為加水量、浸泡時間、煎煮時間。方差分析結(jié)果可知，因素C(加水量)對湯劑質(zhì)量有顯著性影響，因素A(浸泡時間)和因素B(煎煮時間)對湯劑質(zhì)量無影響。同時為縮短湯劑浸泡煎煮的總時間，故四君子湯煎煮工藝最佳組合A1B2C3。即取一劑量的四君子湯，加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min，合并藥液。

2.5 湯劑煎煮文火與武火比較研究 按照上述優(yōu)化出的工藝煎煮，比較文火和武火的差別。文火操作為一直采用文火加熱煎煮。武火操作為先用武火加熱煮沸，然后用用文火保持微沸狀態(tài)。平行3次。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，結(jié)果如表8。

表8 不同火候?qū)λ木訙|(zhì)量的影響 (n=3)

由結(jié)果可見，先武火后文火相較于一直用文火加熱煎煮，人參皂苷的量顯著下降，故四君子湯煎煮應(yīng)該采用一直用文火慢燉的煎煮方法。此結(jié)果與傳統(tǒng)煎煮中補益類藥物煎煮時需慢火熬燉的方法一致。

2.6 不同煎煮器具的比較研究 中藥湯劑煎煮器具與湯劑質(zhì)量密切相關(guān)，歷代醫(yī)藥學(xué)家對湯劑煎煮均很重視。如陶弘景說:“溫湯忌用鐵器”［11］，作者分別采用不銹鋼鍋、砂鍋和養(yǎng)生壺，按照優(yōu)化工藝煎煮，比較三種煎煮器具對湯劑質(zhì)量的影響。每種煎煮器具平行3份。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，結(jié)果如表9。

表9 不同煎煮器具對四君子湯質(zhì)量的影響 (n=3)

綜合上述結(jié)果可知，不銹鋼鍋、砂鍋和養(yǎng)生壺對四君子湯中4種指標(biāo)性成分量的煎出率高低順序為養(yǎng)生壺＞砂鍋＞不銹鋼鍋，而且不銹鋼鍋的煎出率明顯低于養(yǎng)生壺和砂鍋。養(yǎng)生壺煎出有效成分的效率最高。這可能與養(yǎng)生壺煎煮火候穩(wěn)定有關(guān)。

2.7 四君子湯人參另煎方法研究 四君子湯中，人參另煎，加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮時間和次數(shù)見表10。其余3味藥白術(shù)，茯苓，炙甘草采用2.3項下的最佳工藝，即加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min，將煎出液與人參另煎液合并。每份平行3次。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，結(jié)果如表10。

表10 不同的煎煮次數(shù)和煎煮時間對湯劑質(zhì)量的影響 (n=3)

由結(jié)果可知，人參另煎煎煮2次，每次60 min，湯劑中主要指標(biāo)性成分量最高。因此人參另煎的煎煮工藝為加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min。

2.8 人參另煎與不另煎的驗證比較實驗 稱取6劑四君子湯，分別以人參另煎與不另煎兩種最佳工藝煎煮，考察人參另煎對湯劑質(zhì)量的影響。平行3份。湯劑中4種指標(biāo)性成分測定按2.1項下方法進(jìn)行，湯劑浸出物和相對密度測定按照2.2項下進(jìn)行，結(jié)果如表11。

表11 人參另煎與不另煎對湯劑質(zhì)量的影響 (n=3)

由圖表結(jié)果可知，人參另煎湯劑中的主要藥效指標(biāo)成分的量都略高于共煎液。這一實驗結(jié)果驗證了人參另煎這一傳統(tǒng)煎煮方法的合理性。

綜合以上結(jié)果，四君子湯傳統(tǒng)煎煮最佳工藝為將人參置于砂鍋或養(yǎng)生壺中，加12倍量的水浸泡2 h，用文火加熱煎煮，煎煮60 min，煎煮2次。其余三味藥置于砂鍋或養(yǎng)生壺中，加12倍量的水浸泡2 h，用文火加熱煎煮，煎煮60 min，煎煮2次。

3 討論

本研究首次對比了不同煎煮器具在中藥湯劑煎煮過程中對湯劑質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示采用不銹鋼鍋、砂鍋和養(yǎng)生壺煎煮，四君子湯煎液中4種指標(biāo)性成分及湯劑的浸出物和相對密度的高低順序為養(yǎng)生壺＞砂鍋＞不銹鋼鍋，而且不銹鋼鍋的煎煮量明顯低于養(yǎng)生壺和砂鍋。其原因可能是不銹鋼鍋傳熱快，火力不好控制，容易將藥煎糊，需要不斷攪拌，且在煎煮的過程中，損失了大量的水分，導(dǎo)致加水量變化極大，不利于湯劑有效成分的煎出。砂鍋具導(dǎo)熱均勻、緩和，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不會與中藥有效成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，藥鍋保溫性好等優(yōu)點，且養(yǎng)生壺具有可控制火候的功能［12］。由實驗結(jié)果可見，養(yǎng)生壺煎出的有效成分的量最高，故認(rèn)為養(yǎng)生壺煎煮湯劑最好。為臨床湯劑煎煮過程中，怎樣正確的選擇煎煮器具提供了科學(xué)依據(jù)。

本研究以四君子湯作為補益劑的代表方，比較了不同煎煮火候?qū)χ兴幯a益劑質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示先用武火后文火相較于一直用文火，人參皂苷的量顯著下降，故補益類中藥湯劑四君子湯煎煮應(yīng)該采用一直采用文火慢燉的煎煮方法。此結(jié)果為傳統(tǒng)煎煮中補益類藥物煎煮時需慢火熬燉提供了科學(xué)參考依據(jù)。

本研究首次比較了人參另煎與不另煎對湯劑質(zhì)量的影響研究，結(jié)果顯示人參另煎的湯劑中主要藥效指標(biāo)成分的量都略高于共煎液。原因可能是因為處方中的茯苓含有大量的淀粉，隨著煎煮時間的延長，其糊化程度亦隨之增加，從而使煎液中的吸附和包容現(xiàn)象也增加，湯劑中主要指標(biāo)性成分不易溶出。此結(jié)果為傳統(tǒng)煎煮中補益類藥物煎煮時需慢火熬燉提供了科學(xué)參考依據(jù)。

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