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        HPLC法同時(shí)測(cè)定龍血竭片中龍血素A和白藜蘆醇

        2013-09-17 01:31:42程維明楊曉潔黃琴偉陳慧敏張文婷
        中成藥 2013年6期
        關(guān)鍵詞:冰醋酸血竭項(xiàng)下

        程維明, 楊曉潔, 施 貝, 黃琴偉, 陳慧敏, 張文婷*

        (1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)所,浙江杭州310004;2.浙江工業(yè)大學(xué),浙江杭州310014)

        龍血竭為龍舌蘭科植物劍葉龍血樹(shù)Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.H.Chen的含脂木質(zhì)部經(jīng)提取加工制成的樹(shù)脂,具有活血散瘀、消炎止痛、收斂止血、生肌斂瘡、補(bǔ)血益氣等功效[1-4],收載于《國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)》新藥轉(zhuǎn)正第二十二分冊(cè),在臨床上用于治療外科、婦科、內(nèi)科、皮膚科等多種適應(yīng)癥[5],是名貴中藥材之一。龍血竭片系龍血竭藥材研細(xì)后加入適量輔料直接壓片而成的,收載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科氣血津液分冊(cè),主要含黃酮類(lèi)、芪類(lèi)、甾醇類(lèi)和皂苷類(lèi)化合物等成分[6],其中龍血素A(loureirin A)和白藜蘆醇 (resveratrol)等為主要活性成分,是其活血散瘀、生肌斂瘡和補(bǔ)血益氣等功效的物質(zhì)基礎(chǔ),現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)其均具有豐富的生物活性[7-10]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法,同時(shí)測(cè)定龍血竭片中龍血素A和白藜蘆醇的量,該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可作為龍血竭片的質(zhì)量控制方法研究。

        1 儀器與試藥

        Agilent LC1200液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司,配四元泵、智能柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、VMD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器),電子天平 (瑞士Metter公司,AE-163),超聲波清洗器 (上海波龍公司,USC-802),高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)艾本德公司,Centriguge),所用儀器和量具均經(jīng)校正和檢定。

        龍血素A和白藜蘆醇對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為111660-200402、111535-200502;龍血竭片購(gòu)自云南大唐漢方制藥有限公司,批號(hào)為20120305;乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑為分析純。

        2 方法和結(jié)果

        2.1 對(duì)照品溶液的制備

        分別精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的龍血素A和白藜蘆醇對(duì)照品適量,置于50.0 mL量瓶中,加乙腈溶解,并稀釋至刻度,搖勻,制得各對(duì)照品貯備溶液。再分別精密量取1.0 mL龍血素A和白藜蘆醇對(duì)照品貯備溶液置于5.0 mL量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,配成質(zhì)量濃度分別為21.24和23.24μg/mL的對(duì)照品混合溶液。

        2.2 供試品溶液的制備

        取龍血竭片20片,精密稱(chēng)定,研細(xì),過(guò)4號(hào)篩,精密稱(chēng)約0.2 g,置50 mL量瓶中,加硅藻土0.1 g,混勻,加1%冰醋酸溶液-乙腈 (1∶1)混合溶液,超聲處理15 min,放冷,定容,搖勻,取適量離心,即得供試品溶液。

        2.3 色譜條件

        Agilent Zorbax SB-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)-1%冰醋酸(B)梯度洗脫 (0~55 min,20% ~45%A),體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫35℃。在上述色譜條件下,龍血素A和白藜蘆醇的保留時(shí)間分別是50.7 min和14.8 min。見(jiàn)圖1。

        2.4 線性關(guān)系考察

        圖1 對(duì)照品 (A)和供試品 (B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatographs of reference substances(A)and sam p le(B)

        取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,按2.3項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣 1、2、5、10、15、20、30 μL測(cè)定,測(cè)定峰面積,將不同峰面積對(duì)各對(duì)照品進(jìn)樣量做線性回歸,得回歸方程,龍血素A為y=2 400.5x+17.44(r2=0.999 1);白藜蘆醇為y=873.75x+6.45(r2=0.999 8)。結(jié)果表明,龍血素A和白藜蘆醇分別在0.02~0.64μg和0.02~0.70μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

        2.5 精密度試驗(yàn)

        取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液,按2.3項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄龍血素A和白藜蘆醇的峰面積積分值,并計(jì)算它們的RSD值,分別為0.3%、0.3%,結(jié)果表明方法的精密度良好,符合方法學(xué)要求。

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

        取同一份批號(hào)的龍血竭片6份,按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,于2.3項(xiàng)色譜條件下測(cè)定,結(jié)果表明龍血素A的RSD為0.5%,白藜蘆醇的RSD為0.6%,說(shuō)明表明該方法的精密度良好,符合方法學(xué)要求。

        2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取同一份供試品溶液分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h在2.3項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,記錄各對(duì)照品峰面積,結(jié)果表明龍血素A的RSD為1.8%,白藜蘆醇的RSD為1.4%,說(shuō)明供試品溶液在48 h內(nèi)較穩(wěn)定。

        2.8 加樣回收率試驗(yàn)

        精密稱(chēng)取已知龍血素A和白藜蘆醇量的供試品6份,分別精密加入龍血素A和白藜蘆醇的對(duì)照品適量,按2.2項(xiàng)制備供試品溶液后測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)Tab.1 Results of average revovery tests(n=6)

        2.9 樣品測(cè)定

        各批號(hào)龍血竭片分別取3份,研細(xì)后,精密稱(chēng)取適量龍血竭粉末,按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并在2.3項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積,結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Content determination of loureirin A and resveratrol in Longxuejie Tablets

        3 討論

        實(shí)驗(yàn)中比較了不同柱溫 (20℃、35℃、40℃)對(duì)這3種組分的分離效果的影響,結(jié)果表明,隨著柱溫的升高,各組分保留時(shí)間縮短,分離度基本保持一致,但為了保護(hù)柱子,延長(zhǎng)使用壽命,最終確定柱溫為35℃。

        考察了回流提取和超聲提取兩種方法制備供試品溶液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異,但由于超聲提取法具有效率高,操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),所以采用超聲提取法。在提取溶劑的選擇上,分別考察了甲醇和1%冰醋酸溶液-乙腈 (1∶1)混合溶液提取,發(fā)現(xiàn)在相同條件下用后者提取所得的峰面積稍大,說(shuō)明該溶劑提取效率稍好,故選用。同時(shí),在用1%冰醋酸溶液-乙腈 (1∶1)混合溶液提取時(shí),對(duì)不同超聲時(shí)間 (10、15、25、30 min)進(jìn)行了比較,結(jié)合指標(biāo)成分的量,最終確定用1%冰醋酸溶液-乙腈 (1∶1)混合溶液在室溫下超聲提取15 min作為樣品的處理方法。

        考慮到不同色譜柱吸附性能等的差異,在耐受性試驗(yàn)中比較了Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)、Kromasil 100-5C18(250 mm ×4.6 mm)和 Extend-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)3種色譜柱的分離效果,根據(jù)圖譜的分離效果,選擇了 Agilent Zorbax SB-C18進(jìn)行深入的方法學(xué)考察研究。

        [1]向金蓮,程 睿,張路晗.血竭的活血和止血作用研究[J].華西藥學(xué)雜志,2000,15(6):430-431.

        [2]向金蓮,張路晗,程 睿,等.血竭消炎止痛作用研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2001,12(2):110-111.

        [3]農(nóng)興旭.廣西血竭的止血作用[J].中國(guó)中藥雜志,1997,22(4):240242.

        [4]陳德利,高青云,施偉民,等.中藥中活血化瘀藥對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的影響[J].上海醫(yī)學(xué),2000,23(3):145-147.

        [5]文東旭.龍血竭的研究進(jìn)展[J].中草藥,2001,11(32):1053-1054.

        [6]陳軍霞,邱碧菡,潘林梅,等.血竭的現(xiàn)代研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2011,25(3):81-84.

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        [9]胡迎慶,屠鵬飛,李若瑜.劍葉龍血樹(shù)中芪類(lèi)化合物及其抗真菌活性的研究[J].中草藥,2001,32(2):104-106.

        [10]劉兆平,于 波.白藜蘆醇的雌激素樣作用研究[J].衛(wèi)生研究,2002,31(3):188-190.

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