程維明， 楊曉潔， 施 貝， 黃琴偉， 陳慧敏， 張文婷*

(1．浙江省食品藥品檢驗(yàn)所，浙江杭州310004;2．浙江工業(yè)大學(xué)，浙江杭州310014)

龍血竭為龍舌蘭科植物劍葉龍血樹(shù)Dracaena cochinchinensis(Lour．)S．H．Chen的含脂木質(zhì)部經(jīng)提取加工制成的樹(shù)脂，具有活血散瘀、消炎止痛、收斂止血、生肌斂瘡、補(bǔ)血益氣等功效［1-4］，收載于《國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)》新藥轉(zhuǎn)正第二十二分冊(cè)，在臨床上用于治療外科、婦科、內(nèi)科、皮膚科等多種適應(yīng)癥［5］，是名貴中藥材之一。龍血竭片系龍血竭藥材研細(xì)后加入適量輔料直接壓片而成的，收載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科氣血津液分冊(cè)，主要含黃酮類、芪類、甾醇類和皂苷類化合物等成分［6］，其中龍血素A(loureirin A)和白藜蘆醇 (resveratrol)等為主要活性成分，是其活血散瘀、生肌斂瘡和補(bǔ)血益氣等功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)其均具有豐富的生物活性［7-10］。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定龍血竭片中龍血素A和白藜蘆醇的量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為龍血竭片的質(zhì)量控制方法研究。

1 儀器與試藥

Agilent LC1200液相色譜儀 (美國(guó)安捷倫公司，配四元泵、智能柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、VMD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器)，電子天平 (瑞士Metter公司，AE-163)，超聲波清洗器 (上海波龍公司，USC-802)，高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)艾本德公司，Centriguge)，所用儀器和量具均經(jīng)校正和檢定。

龍血素A和白藜蘆醇對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為111660-200402、111535-200502;龍血竭片購(gòu)自云南大唐漢方制藥有限公司，批號(hào)為20120305;乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的龍血素A和白藜蘆醇對(duì)照品適量，置于50.0 mL量瓶中，加乙腈溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制得各對(duì)照品貯備溶液。再分別精密量取1.0 mL龍血素A和白藜蘆醇對(duì)照品貯備溶液置于5.0 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為21.24和23.24μg/mL的對(duì)照品混合溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取龍血竭片20片，精密稱定，研細(xì)，過(guò)4號(hào)篩，精密稱約0.2 g，置50 mL量瓶中，加硅藻土0.1 g，混勻，加1%冰醋酸溶液-乙腈 (1∶1)混合溶液，超聲處理15 min，放冷，定容，搖勻，取適量離心，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈 (A)-1%冰醋酸(B)梯度洗脫 (0～55 min，20% ～45%A)，體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫35℃。在上述色譜條件下，龍血素A和白藜蘆醇的保留時(shí)間分別是50.7 min和14.8 min。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

圖1 對(duì)照品 (A)和供試品 (B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatographs of reference substances(A)and sam p le(B)

取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣 1、2、5、10、15、20、30 μL測(cè)定，測(cè)定峰面積，將不同峰面積對(duì)各對(duì)照品進(jìn)樣量做線性回歸，得回歸方程，龍血素A為y=2 400.5x+17.44(r2=0.999 1);白藜蘆醇為y=873.75x+6.45(r2=0.999 8)。結(jié)果表明，龍血素A和白藜蘆醇分別在0.02～0.64μg和0.02～0.70μg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄龍血素A和白藜蘆醇的峰面積積分值，并計(jì)算它們的RSD值，分別為0.3%、0.3%，結(jié)果表明方法的精密度良好，符合方法學(xué)要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份批號(hào)的龍血竭片6份，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，于2.3項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，結(jié)果表明龍血素A的RSD為0.5%，白藜蘆醇的RSD為0.6%，說(shuō)明表明該方法的精密度良好，符合方法學(xué)要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h在2.3項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄各對(duì)照品峰面積，結(jié)果表明龍血素A的RSD為1.8%，白藜蘆醇的RSD為1.4%，說(shuō)明供試品溶液在48 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知龍血素A和白藜蘆醇量的供試品6份，分別精密加入龍血素A和白藜蘆醇的對(duì)照品適量，按2.2項(xiàng)制備供試品溶液后測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)Tab.1 Results of average revovery tests(n=6)

2.9 樣品測(cè)定

各批號(hào)龍血竭片分別取3份，研細(xì)后，精密稱取適量龍血竭粉末，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并在2.3項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Content determination of loureirin A and resveratrol in Longxuejie Tablets

3 討論

實(shí)驗(yàn)中比較了不同柱溫 (20℃、35℃、40℃)對(duì)這3種組分的分離效果的影響，結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，各組分保留時(shí)間縮短，分離度基本保持一致，但為了保護(hù)柱子，延長(zhǎng)使用壽命，最終確定柱溫為35℃。

考察了回流提取和超聲提取兩種方法制備供試品溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異，但由于超聲提取法具有效率高，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，所以采用超聲提取法。在提取溶劑的選擇上，分別考察了甲醇和1%冰醋酸溶液－乙腈 (1∶1)混合溶液提取，發(fā)現(xiàn)在相同條件下用后者提取所得的峰面積稍大，說(shuō)明該溶劑提取效率稍好，故選用。同時(shí)，在用1%冰醋酸溶液－乙腈 (1∶1)混合溶液提取時(shí)，對(duì)不同超聲時(shí)間 (10、15、25、30 min)進(jìn)行了比較，結(jié)合指標(biāo)成分的量，最終確定用1%冰醋酸溶液－乙腈 (1∶1)混合溶液在室溫下超聲提取15 min作為樣品的處理方法。

考慮到不同色譜柱吸附性能等的差異，在耐受性試驗(yàn)中比較了Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)、Kromasil 100-5C18(250 mm ×4.6 mm)和 Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)3種色譜柱的分離效果，根據(jù)圖譜的分離效果，選擇了 Agilent Zorbax SB-C18進(jìn)行深入的方法學(xué)考察研究。

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