王國富 吳利先 薛士鵬

腸球菌長期以來被認(rèn)為致病力較低而未引起重視，但近年來，腸球菌屬條件致病菌所致感染的發(fā)生率持續(xù)升高，尤其在原有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病及機(jī)體免疫力降低時，極易侵入體內(nèi)或易位，導(dǎo)致局部或全身重癥感染，給臨床治療帶來困難。目前，腸球菌已成為醫(yī)院感染的主要致病菌，又容易形成生物被膜，臨床上細(xì)菌生物被膜可形成于各種生物置入材料表面及體內(nèi)黏膜表面，具有極強(qiáng)的耐藥性及免疫逃避性，是造成臨床慢性感染的主要原因之一。腸球菌表面蛋白(enterococca surface protein，ESP)是由esp基因所編碼的。與腸球菌生物被膜的形成及免疫逃逸有關(guān)［1］，而生物被膜的形成及免疫逃逸是細(xì)菌耐藥株出現(xiàn)和傳播的必要風(fēng)險因子［2］。因此，了解esp基因在腸球菌在臨床的流行情況，分析esp基因的存在狀況與腸球菌之間耐藥的相關(guān)性就顯得非常必要。對此本研究對從醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)感染患者分離得到的94株腸球菌進(jìn)行esp基因與萬古霉素耐藥的相關(guān)性研究，結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床菌株 94株腸球菌來自醫(yī)院7個ICU病房患者的臨床標(biāo)本［3］。藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC2592和糞腸球菌ATCC29212為本室保存。

1.2 試劑材料 萬古霉素和替考拉林標(biāo)準(zhǔn)品購自美國禮來公司。地高辛標(biāo)記的探針檢測試劑盒購自美國羅氏公司。用于屎腸球菌和糞腸球菌esp基因擴(kuò)增的2對引物［4，5］由上海生工合成。屎腸球菌esp基因的引物，P1:5’-TTGCTAAT-GCAGTCCACGA CC-3’和 P2:5’-GCGTCAACACTIGCATTGCCGA-3’;糞腸球菌esp基因的引物P1:5’-GTGTGGGTGTTGCATCAGTATT-3’和 P2:5’-CATACTGGGCCAATC GTTCATC-3’。

1.3 方法

1.3.1 菌株對萬古霉素和替考拉林MIC測定和耐藥性判定按照NCCLS推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，測定94株菌對萬古霉素和替考拉林的MIC值，按照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)對耐藥性進(jìn)行判斷。

1.3.2 腸球菌esp基因分布的檢測 使用參照文獻(xiàn)［6］的高特異性菌落雜交法。具體步驟為將尼龍膜剪切后放置于培養(yǎng)腸球菌的BHI平板表面，然后用96孔接種器將增菌培養(yǎng)后的腸球菌接種于尼龍膜表面培養(yǎng)過夜。用溶菌酶、NaOH、氯仿和乙醇處理，使細(xì)菌DNA結(jié)合于膜表面，并置于4℃的冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ煤铣傻囊镞M(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測序，保證獲得正確的序列。采用地高辛標(biāo)記試劑盒提供的方法標(biāo)記探針，獲得檢測esp基因的探針，按試劑盒說明進(jìn)行雜交和檢測，并統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 94株腸球菌對萬古霉素和替考拉林的耐藥性 屎腸球菌和糞腸球菌對萬古霉素和替考拉林的耐藥率檢測結(jié)果見表1。屎腸球菌的耐藥率明顯高于糞腸球菌對萬古霉素和替考拉林的耐藥率。

表1 糞腸球菌與屎腸球菌對萬古霉素和替考拉林的抗菌敏感性比較(例，%)

2.2 esp基因的分布與萬古霉素耐藥的相關(guān)性 試驗(yàn)對94株腸球菌(其中糞腸球菌63株，屎腸球菌31株)的esp基因進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示63株糞腸球菌中有24株(38.1%)esp基因?yàn)殛栃?。結(jié)合耐藥檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有對萬古霉素和替考拉林耐藥和中介菌株esp基因均為陽性。而31株屎腸球菌中有13株(41.9%)esp基因?yàn)殛栃?。結(jié)合耐藥檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)這13株中同樣包括了對萬古霉素和替考拉林耐藥和中介的屎腸球菌菌株。結(jié)果見表2和表3。

表2 esp基因在細(xì)菌中的分布(例，%)

表3 esp基因與萬古霉素耐藥相關(guān)性比較

3 討論

近年來，臨床上多重耐藥G+菌感染的形勢越來越嚴(yán)重，其中腸球菌(Enterococcus)是主要的病原菌之一，其感染已成為醫(yī)院內(nèi)感染病原菌的第2位。隨著對腸球菌致病機(jī)制的逐步深入，發(fā)現(xiàn)腸球菌與多種置入醫(yī)療器材如導(dǎo)尿管、靜脈插管和人工瓣膜所引起的生物被膜相關(guān)感染有關(guān)，而esp基因編碼的ESP蛋白在腸球菌生物被膜形成中起了重要的作用。萬古霉素一度被認(rèn)為是臨床抗感染的最后一道防線，但目前各個國家和地區(qū)均有報道出現(xiàn)了耐萬古霉素的腸球菌菌株，成了臨床治療的一大難題。為了解本地區(qū)腸球菌的耐藥趨勢以及esp基因與萬古霉素耐藥的相關(guān)性，本研究將ICU分離到的94株腸球菌進(jìn)行了萬古霉素和替考拉的耐藥性檢測。結(jié)果在糞腸球菌中檢出4株(6.35%)替考拉林耐藥菌株;檢出3株(4.76%)萬古霉素耐藥菌株，而屎腸球菌檢出5株(16.1%)替考拉林耐藥菌株，萬古霉素耐藥菌株7株(22.58%)，糞腸球菌耐藥率明顯低于屎腸球菌對替考拉林和萬古霉素的耐藥率，這一結(jié)果比其他醫(yī)院報道的結(jié)果要高［7］。主要的原因可能是本研究檢測的細(xì)菌是來自重癥監(jiān)護(hù)病房，這里的患者一般均有基礎(chǔ)疾病，需要長期使用抗生素所至。

本研究還對同批94株腸球菌進(jìn)行了esp基因檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示63株糞腸球菌中有24株菌的esp基因?yàn)殛栃浴?1株屎腸球菌中13株菌esp基因陽性，比國外報道相對要低。在所有對萬古霉素和替考拉林耐藥和中介的糞腸球菌和屎腸球菌esp基因均為陽性。這說明esp基因分布與腸球菌對萬古霉素耐藥的關(guān)系非常密切。這可能與Esp蛋白有獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)，可以改變蛋白表達(dá)形式，而這種細(xì)胞壁表面的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使腸球菌能避過免疫宿主的阻擋，在強(qiáng)大的抗菌藥物選擇性壓力下繼續(xù)生存，而且陽性株耐藥的esp比陰性株esp更易傳播。兩外還與esp基因與細(xì)菌生物被膜形成有關(guān)。在生物被膜的保護(hù)下，細(xì)菌可以相互交流，協(xié)同生長，形成細(xì)菌微環(huán)境，而不易被殺滅［8］。生物被膜的產(chǎn)生使生物被膜內(nèi)細(xì)菌對抗生素的耐藥性比浮游細(xì)菌增加了10～1000倍，更能夠抵抗機(jī)體的免疫效應(yīng)和抗生素的殺菌作用。由此得出腸球菌esp基因的存在與細(xì)菌耐萬古霉素密切相關(guān)，從而esp基因的存在就為腸球菌耐藥性監(jiān)測提供了一個有用的分子標(biāo)志物，有助于將Esp蛋白作為臨床抗腸球菌屬治療的一個新靶位，達(dá)到控制腸球菌感染和耐藥逐漸上升的目的。

［1］Toledo-Arana A，Valle J，Solano C，et a1.The Enterococcus surface protein，ESP，is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation.Appl Environ Microbiol，2001，67(10):4538-4545.

［2］Coque TM，Willems R，Canton R，et a1.High occurrence of esp among ampicillin-resistant and vancomycin-susceptible Enterococcus faecium clones from hospitalized patients.J Antimicrob Chemother，2002，50(8):1035-1038.

［3］吳利先，王國富，鄭行萍.重癥監(jiān)護(hù)病房的腸球菌種類及其耐藥性分析.大理學(xué)院學(xué)報，2007，6(10):28-30.

［4］Van Wamel WJ，Hendrickx AP，Bonten MJ，et a1.Growth condition-dependent Esp expression by Enterococcus faecium affects initial adherence and biofilm formation .Infect Immun，2007，75(2):924-931.

［5］Shankar N，Lockatell C V，Baghdayan A S，et a1.Role of Enterococcus faecalis surface protein Esp in the pathogenesis of ascending urinary tract infection.Infect Immune，2001，69(7):4366-4372.

［6］王國富，吳利先，薛士鵬.ICU腸球菌屬esp基因分布及對萬古霉素耐藥的相關(guān)性研究.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22(13):2724-2726.

［7］王德，蘇琪，王麗.184株腸球菌的臨床分布及耐藥性分析.中國抗生素雜志，2010，35(2):160，S1-S3.

［8］周索蘭，鮑亞澤，洪霞，等.醫(yī)院內(nèi)尿路感染病原菌的監(jiān)測及耐藥性分析.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17(12):1590-1593.