韓曉瑩，陳 紅*

(1.貴州省果樹工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025;2.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550025)

酥李又名冰脆李，是薔薇科李屬植物，屬于中國李，其果實色綠、質脆、味甜，遺傳多樣性較高，為地方良種之一[1]。對于李屬植物的組織培養(yǎng)，國內外已有報道[2－4]，而對中國李的研究較少，尤其是對貴州酥李此方面的研究，至今未見報道。貴州自然災害頻繁，資源管理粗放，許多種于房前屋后，易造成特異資源的流失。因此，本文以貴州優(yōu)良李資源酥李為材料，探討建立組培快繁體系的適宜條件，為李資源的超低溫保存及種質資源創(chuàng)新利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自貴州大學李種質資源圃5年生酥李半木質化枝條。試驗于2011年5月—2012年5月在貴州省果樹工程技術研究中心進行。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌時間的篩選 取當年生半木質化枝條，保留小段葉柄，用流水沖洗1 h。消毒時將材料置于體積分數(shù)75%酒精中浸泡30 s，再用1 g/L HgCl2消毒不同時間(6，8，10，12，14 min)，用無菌水沖洗3～5次后，將材料切成單芽或多芽莖段接種于培養(yǎng)基中。

1.2.2 初代誘導培養(yǎng)植物生長調節(jié)劑濃度的篩選 以WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質量濃度的6 －BA(0.5，1.0，2.0 mg/L)、NAA(0.05，0.1 mg/L)、KT 0.5 mg/L 進行初代培養(yǎng)。每個外植體帶 1 ～2個腋芽。

1.2.3 增殖培養(yǎng)植物生長調節(jié)劑濃度的篩選 以初代培養(yǎng)誘導的芽為外植體，接種到以WPM為基本培養(yǎng)基，添加有不同質量濃度的 6 －BA(0.5，1.0 mg/L)、NAA(0.05，0.1 mg/L)、KT(0.5，1.0 mg/L)、IBA(0.05，0.1，0.2，0.3 mg/L)的增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。

1.2.4 生根培養(yǎng)基篩選與移栽 將生長健壯的芽苗接種到1/2 MS+0.4 mg/L IBA+15 g/L蔗糖和WPM+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA+15 g/L蔗糖的培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。生根后2個月，將植株取出洗凈根部培養(yǎng)基，浸入1 g/L KMnO4溶液中消毒10 s，移栽至已滅菌的營養(yǎng)土中。

1.2.5 培養(yǎng)條件 在進行初代、增殖培養(yǎng)時，培養(yǎng)基附加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH5.8，121℃滅菌15 min。接種后置于培養(yǎng)室內，每天光照14～16 h，光照強度2 000～3 000 lx，培養(yǎng)溫度(25±1)℃。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理 用DPSv7.05軟件進行數(shù)據(jù)處理。

外植體接種1個月后統(tǒng)計污染率、褐化率及萌發(fā)率;新梢增殖培養(yǎng)1個月后統(tǒng)計增殖倍數(shù)和生長情況;試管苗誘導生根后兩周統(tǒng)計生根情況及移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 外植體的消毒效果

從表1可知，消毒時間對外植體污染率、褐化率、萌發(fā)率有顯著的影響，隨著消毒時間的延長，污染率和萌發(fā)率均呈下降趨勢。酥李莖段用1 g/L HgCl2消毒6 min時，萌發(fā)率達96.3%，污染率也高達92.8%。而消毒14 min時，污染率雖只有19.88%，但萌發(fā)率也僅19.9%。綜合比較，適宜的外植體消毒時間為1 g/LHgCl2處理8 min。

表1 不同消毒時間對酥李莖段的影響Tab.1 Effect of different disinfection time on bud stems of crisp plum

2.2 不同植物生長調節(jié)劑濃度配比對初代誘導的影響

不同質量濃度的細胞分裂素對酥李腋芽誘導效果不同，在一定范圍內，隨著細胞分裂素質量濃度的增加，酥李腋芽誘導率不斷增加。由表2可知，當細胞分裂素6－BA為1.0 mg/L、生長素NAA濃度為0.1 mg/L時，酥李腋芽誘導率達最高為96%，誘導出的腋芽生長健壯，葉色濃綠(圖版－A);但當6－BA為2.0 mg/L時，腋芽誘導率有所降低，此時腋芽長勢較差，葉色發(fā)黃，逐漸脫落，大部分出現(xiàn)玻璃化苗，已不適合李腋芽誘導。因此，培養(yǎng)基WPM+1.0 mg/L 6－BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA比較適合酥李腋芽誘導。

表2 植物生長調節(jié)劑對酥李腋芽生長的影響Tab.2 Effects of different plant growth regulators combination on buds growth of crisp plum

2.3 植物生長調節(jié)劑質量濃度對芽苗增殖和生長的影響

將萌發(fā)的新梢剪下并接種到WPM培養(yǎng)基上，配合不同質量濃度的細胞分裂素和生長素進行試驗(表3)發(fā)現(xiàn)，酥李在細胞分裂素6－BA、生長素NAA的培養(yǎng)基中生長不良，葉脈間失綠，葉片逐漸變黃脫落。而在細胞分裂素為1.0 mg/L KT、生長素0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基上，植株生長健壯，葉色濃綠，增殖倍數(shù)達3.5。當KT為1.0 mg/L時，隨著IBA質量濃度的升高，芽誘導率下降，當濃度為0.3 mg/L時，增殖倍數(shù)僅有 1.17。同時，設置不同濃度的 GA3，即 0.0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mg/L，觀察試管苗的生長狀況。從試管苗的長勢和增殖情況看，1.0 mg/L的GA3為最佳。故適宜增殖培養(yǎng)基配方為WPM+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L IBA+1.0 mg/L GA3(圖版 －B)。

表3 植物生長調節(jié)劑對增殖倍數(shù)的影響Tab.3 Effects of different plant growth regulators combination on buds proliferation of crisp plum

2.4 不同基本培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑對生根的影響

當新梢長至2 cm以上時，選取生長健壯的試管苗，轉接到生根培養(yǎng)基上進行誘導生根。結果表明，采用1/2MS+0.4 mg/L IBA的培養(yǎng)基生根效果較好(圖版－C)，生根率為95%，平均生根數(shù)達9.5條，與另一處理的平均生根數(shù)存在顯著差異，且不經(jīng)愈傷組織從新稍基部直接發(fā)出不定根。而在WPM+0.5 mg/L KT+0.05 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，生根顯著推遲且根條數(shù)明顯減少。選取根系發(fā)達的生根苗植株，移出洗去根部培養(yǎng)基，栽入無菌營養(yǎng)土中，溫室鍛煉30 d，移栽成活率達90%以上(圖版－D)。

表4 不同基本培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑對生根的影響Tab.4 Effects of different media and plant growth regulators combination on rooting of crisp plum

圖版A:腋芽誘導芽苗生長良好;B:芽苗增殖生長;C:生根;D:移栽至溫室1個月后的生長情況。Plates A:Induction of axillary buds and vigorous growth;B．Proliferation of buds;C:Roots of crisp plum;D．Transplant to greenhouse after one month situation．

3 討論

外植體消毒是植物組織培養(yǎng)過程中極為重要的步驟。消毒時間過長，材料生活力弱，褐化、死亡嚴重，進一步影響萌發(fā)。反之，時間過短消毒不徹底，造成外植體接種后未萌發(fā)就污染，成活率也低。故置于體積分數(shù)75%酒精內浸30 s，1 g/L升汞溶液處理8 min為宜。另外，木質化程度高的外植體，消毒越不容易，污染越嚴重。同時，本試驗還發(fā)現(xiàn)，不同取材季節(jié)對消毒處理后的萌發(fā)率也有很大影響。

本文又以MS為基本培養(yǎng)基進行試驗，發(fā)現(xiàn)新梢在兩種基本培養(yǎng)基上生長狀況差異顯著。在WPM基本培養(yǎng)基上，新梢增殖倍數(shù)高，葉色濃綠，植株生長健壯。而在MS培養(yǎng)基上長勢不佳，葉片變黃脫落，節(jié)間不伸長，說明此培養(yǎng)基不適合酥李的增殖培養(yǎng)。故新梢在WPM培養(yǎng)基上生長較好。分析兩種培養(yǎng)基中大量元素的含量，可能是因為WPM培養(yǎng)基中N的質量濃度較低、Ca的質量濃度升高的原因。相較之下，WPM更適合中國李的組織培養(yǎng)，這與前人[5－6]的研究結果一致。

植物生長調節(jié)劑在植物生長發(fā)育過程中起到調節(jié)作用，而不同種類和濃度的組合對植物增殖的效果明顯不同[7]。有關結果表明，培養(yǎng)基中植物生長調節(jié)劑類型、濃度和組合決定了組織、器官的發(fā)育和分化方向，當生長素與細胞分裂素比值低時有利于長芽，比值高時有利于長根，中間比值有利于愈傷組織的誘導和分化[8－10]。同時，在培養(yǎng)基中加入細胞分裂素能夠促進細胞分裂和增殖[11－13]。在莖尖培養(yǎng)中，許多研究者都加入GA3，以促進莖尖的萌發(fā)和伸長，提高莖尖培養(yǎng)成苗率[14]。本試驗發(fā)現(xiàn)，GA3對植株節(jié)間的伸長起重要作用，但質量濃度不宜過高。過高，植株生長迅速，卻纖細瘦弱;過低，對植株無明顯影響，生長健壯但節(jié)間不伸長。因此，培養(yǎng)基中適宜的GA3為1.0 mg/L。但是，在陳君幟等[15]的試驗研究中，觀察到加入GA3對促進成苗并無很大影響，質量濃度高了反而會降低成苗率，這可能是因為不同樹種及不同基因型所需激素的種類和質量濃度不同。

培養(yǎng)基及生長素種類、質量濃度是影響生根的主要因素。浦艷吉等[16]采用1/2MS+1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)歐洲李和櫻桃李的生根率分別達到98.3%和94.1%。趙艷華等[17]用1/2MS+0.3 mg/LIAA+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基對李新梢進行生根培養(yǎng)，生根率達95%以上。孫新政等[18]鈣果4號歐李在1/2MS+1.0 mg/LIBA+0.02 mg/L KT中生根率高達100%。本試驗采用1/2MS、WPM為基本培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)。試驗發(fā)現(xiàn)，新稍在兩種基本培養(yǎng)基上的生根率無顯著差異，但生根條數(shù)差異顯著，且在1/2MS+0.4 mg/L IBA上生根效果較好，生根率達95%，根條數(shù)較多，利于移栽。雖然1/2MS和WPM中N的含量相差不大，但是不同的植物生長調節(jié)劑對植物生根的效果不同。綜合比較，酥李的適宜生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.4 mg/L IBA+1.5%蔗糖。試驗證明誘導酥李生根容易，根生長良好。

致謝:陳紅副教授對本文的撰寫、修改給予了悉心指導，周金忠同學在試驗過程中給予了幫助，謹致謝意!

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