鄭金丹，劉麗麗

1遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121000；2遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，遼寧錦州 121000

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病因尚不清楚，長(zhǎng)期受雌激素刺激而無(wú)孕酮拮抗可能是其主要發(fā)病因素。孕激素是保護(hù)子宮內(nèi)膜的重要因素，亦是內(nèi)分泌治療子宮內(nèi)膜癌的重要方法，可使子宮內(nèi)膜癌腺體向良性逆轉(zhuǎn)[1]。孕激素通過(guò)與其受體(progesterone receptor，PR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而PR陽(yáng)性被認(rèn)為是臨床內(nèi)分泌治療激素依賴性子宮內(nèi)膜癌的關(guān)鍵。最近，Stratmann，Haendler[2]在研究人類乳腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中存在JARID1A基因過(guò)渡表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，沉默JARID1A基因可上調(diào)PR表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Sharma在建立腫瘤細(xì)胞株對(duì)抗癌藥物敏感性模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，染色質(zhì)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥可逆狀態(tài)需要JARID1A參與[3]。本研究旨在通過(guò)SiRNA干擾JARID1A基因表達(dá)，探討其對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖凋亡的影響。

材料和方法

1 材料 人子宮內(nèi)膜癌高分化細(xì)胞系Ishikawa(ER、PR高表達(dá))由北京大學(xué)人民醫(yī)院惠贈(zèng)。DMEM/F-12培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，PR抗體Santa Cruz分裝，重組人雌二醇HSD17B1(E2)購(gòu)自Sigma公司，JARID1A抗體購(gòu)自Cell signaling，轉(zhuǎn)染試劑盒和DharmaFECT1轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Dharmacon公司，四條JARID1A siRNA由Dharmacon公司設(shè)計(jì)合成。RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng) Ishikawa細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到70%以上時(shí)傳代，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

3 SiRNA轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞 根據(jù)前期工作基礎(chǔ)選擇1條干擾效果理想的序列進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照(untr)不作任何處理，陰性對(duì)照(siCo)采用不針對(duì)任何基因的siRNA。JARID1A siRNA：5'-GCAAAU GAGACAACGGAAA-3'； JARID1A Non-Targeting siRNA：5'-UUCUCCGAACUUGUCACAUUU-3'，轉(zhuǎn)染過(guò)程按轉(zhuǎn)染說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染成功后將細(xì)胞放入CO2培養(yǎng)箱，37 ℃溫育24~48 h，進(jìn)行后續(xù)操作。

4 細(xì)胞RNA提取及RT-PCR 使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按TaKaRa公司RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作?？俁NA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)OD260和OD280值，兩者比值在1.8~2.0之間的RNA純度為好。反轉(zhuǎn)錄使用Oligo(dT)引物，合成cDNA條件為：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl。PCR引物經(jīng)Gene Bank上的Blast比對(duì)后委托TaKaRa公司合成，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖，100伏電泳30 min，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)(Bio Imaging System，UVP，USA)觀察。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，引物見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers

5 蛋白提取及Western Blotting 細(xì)胞裂解液(pierce)提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%濃縮膠，每孔加入20 μl樣品后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)封閉后，加入PR多克隆一抗(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，TTBS洗滌加PR標(biāo)記的兔抗山羊二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育2 h，洗膜后加入ECL發(fā)光試劑,蛋白條帶用Bio Imaging System采集后進(jìn)行灰度值測(cè)定，目的蛋白與β-actin的灰度值比值即為該樣品的蛋白相對(duì)含量。

6 CCK8檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞增殖 將sicon組、sicon+e2組、siJARID1A組和siJARID1A+e2組的Ishikawa細(xì)胞以每孔1 000個(gè)細(xì)胞密度接種96孔板中，重復(fù)種植4個(gè)96孔板，分別用來(lái)檢測(cè)24 h、48 h、72 h、96 h細(xì)胞的增殖，450 nm條件下檢測(cè)吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，每組細(xì)胞平均吸光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將sicon組、sicon+e2組、 siJARID1A組和siJARID1A+e2組的Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，分別加入1 ml PBS，1 500 g離心5 min，棄上清,加入400 μl碘化啶液(PI)，室溫避光30 min，流式細(xì)胞儀(BD bioscience)檢測(cè)細(xì)胞周期。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，單因素方差分析，對(duì)Ishikawa細(xì)胞吸光值進(jìn)行Fried-man檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

結(jié) 果

1 干擾效率 Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA后, JARID1A mRNA表達(dá)降低，見(jiàn)圖1。

2 E2對(duì)PR表達(dá)的影響 不同濃度E2均能上調(diào)Ishikawa細(xì)胞中PR mRNA的表達(dá)，在E2濃度100 nmol/L時(shí)，PR mRNA上調(diào)最明顯(P＜0.05),見(jiàn)圖2。

3 SiRNA對(duì)PR表達(dá)的影響 Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染JARID1A SiRNA后，PR蛋白表達(dá)增加，PR mRNA表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖3、4。

圖1 JARID1A基因干擾效率 與siCo組相比，siJARID1A組中JARID1A mRNA表達(dá)明顯降低(aP＜0.01)Fig.1 Interference with JARID1A gene expression on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells aP＜0.01 vs siCo group

圖2 RT-PCR檢測(cè)PR mRNA表達(dá)Fig.2 RT-PCR-detected PR mRNA expression

圖3 Western Blot檢測(cè)PR蛋白表達(dá) 與sicon組和sicon+e2組相比較，siJARID1A組和siJARID1A+e2組細(xì)胞中PR蛋白表達(dá)增加(P＜0.01)Fig.3 Western blot-detected PR protein expression. P＜0.01 vs siCo group and sicon+e2 group

圖4 RT-PCR檢測(cè)PR mRNA表達(dá) 與sicon組相比，siJARID1A組中PR mRNA表達(dá)增加(aP＜0.01)；與sicon+e2組相比，siJARID1A+e2組PR mRNA表達(dá)上調(diào)(bP＜0.05)Fig.4 RT-PCR-detected PR mRNA expression aP＜0.01, vs siCo group; bP＜0.05, vs sicon+e2 group

圖5 細(xì)胞增殖曲線Fig.5 Proliferation curves of Ishikawa cells

圖6 細(xì)胞周期 與sicon組、sicon+e2組相比，siJARID1A組和siJARID1A+e2組細(xì)胞G1、G2/M期受到抑制(aP＜0.01，bP＜0.05)Fig.6 Cell cycle of Ishikawa cells aP＜0.01, vs siCo group; bP＜0.05, vs sicon+e2 group

4 細(xì)胞增殖情況 Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染JARID1A Si-RNA 48 h后，細(xì)胞增殖速度明顯減慢，sicon、sicon+e2組細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后達(dá)對(duì)數(shù)增殖期，而siJARID-1A和siJARID1A+e2組細(xì)胞缺乏對(duì)數(shù)增殖特征，見(jiàn)圖5。

5 細(xì)胞周期變化 JARID1A siRNA抑制Ishikawa細(xì)胞G1、G2/M期，見(jiàn)圖6。

討 論

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其最常見(jiàn)病因是過(guò)量雌激素長(zhǎng)期刺激的結(jié)果[4]。雌激素可刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生，也可在DNA轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)下游基因PR的生成，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[5]。本研究選取ER、PR均陽(yáng)性的Ishikawa細(xì)胞系，結(jié)果證實(shí)不同濃度的E2均可以上調(diào)PR基因的表達(dá)，在E2濃度為100 nmol/L時(shí)，PR基因表達(dá)上調(diào)最明顯，提示在PR陽(yáng)性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，雌激素可上調(diào)PR的表達(dá)，為臨床內(nèi)分泌治療子宮內(nèi)膜癌提供理論依據(jù)。

JARID1A屬于JARID1蛋白家族成員之一，起初被描述為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白，有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化的作用[6]。最近研究證實(shí)JARID1A是一種組蛋白去甲基化酶，與其他組蛋白去甲基化酶不同，JARID1A通過(guò)自身ARID區(qū)域識(shí)別一組特殊的CCGCCCDNA序列調(diào)控下游基因表達(dá)[7-8]。全基因組分析結(jié)果表明，JARID1A控制著兩組基因，一組涉及細(xì)胞分化的調(diào)控，另一組調(diào)控細(xì)胞線粒體的功能及RNA/DNA代謝[9]。本研究應(yīng)用SiRNA干擾JARID1A基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾JARID1A(si JARID1A、siJARID1A+e2組)能顯著增加PR基因表達(dá)，上調(diào)PR蛋白表達(dá)。

腫瘤被認(rèn)為是一類細(xì)胞周期性疾病，腫瘤細(xì)胞的主要生物學(xué)特性表現(xiàn)為侵襲生長(zhǎng)[10]。實(shí)驗(yàn)中我們采用MTT法觀察Ishikawa細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染SiRNA 48 h后，腫瘤細(xì)胞增殖速度明顯減慢，曲線低平，與對(duì)照組相比缺乏對(duì)數(shù)增殖特征；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SiRNA后腫瘤細(xì)胞的G1、G2/M期受到抑制。

本研究證實(shí)，JARID1A siRNA能有效抑制Ishikawa細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是通過(guò)上調(diào)PR基因表達(dá)以拮抗雌激素的生物學(xué)效應(yīng)來(lái)完成。JARID1A是如何上調(diào)PR基因的表達(dá)仍需進(jìn)一步深入研究，而JARID1A基因的發(fā)現(xiàn)則有望成為子宮內(nèi)膜癌治療的新靶點(diǎn)。

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