張鳳香，賀成業(yè), 關 寧，李晨光，羅俊生

遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 心外科，遼寧錦州 121001

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)嚴重危害人類健康，引發(fā)心腦血管疾病，是一種常見和多發(fā)的疾病，其發(fā)病率和病死率均較高。因此，預防和控制AS疾病是亟待解決的問題。白藜蘆醇(resveratrol)是一種非黃酮類多酚化合物，存在于葡萄科、百合科、豆科等多種植物中[1]。大量研究結果顯示，白藜蘆醇具有保護心血管、抗腫瘤、抗炎癥和抗氧化等多方面作用；白藜蘆醇經(jīng)口服后能迅速被人體吸收、分布和代謝[2-3]。我們前期研究已初步探明白藜蘆醇能通過增強膽固醇酯水解酶(carboxylic ester hydrolase，CEH)的表達抑制泡沫細胞形成，并且促進膽固醇外流。本研究是在此基礎上用動物實驗進一步驗證白藜蘆醇是否可通過影響CEH表達預防動脈粥樣硬化形成。

材料和方法

1 實驗動物及材料 ApoE-/-小鼠雄性40只，8周齡，購自北京維通利華有限公司(動物許可證編號SCXK京2006-0004)。飼養(yǎng)于符合二級動物飼養(yǎng)標準的遼寧醫(yī)學院動物研究所。白藜蘆醇購自Sigma公司；補體因子H(complement factor H，CFH)多克隆抗體、VCAM-1多克隆抗體、鼠抗β-actin一抗、二抗均購自美國Abcam公司；DAB顯色試劑盒購自碧云天公司；CEH的基因序列由QIAGEN公司設計；CEH siRNA的序列：CEH siRNA正義鏈5'-UCAGGACUUGGCUGAACUUU-3'；反義鏈5'-AGA UAGCCAAGUCGGCGACA-3'。

2 分組 將動物模型分為四組，每組10只。白藜蘆醇組：100 μg/kg小鼠腹腔注射，每周2次，高脂飲食，共10周。CEH siRNA組：100 μl/100 μl PBS腹腔注射，每周2次，高脂飲食，共10周。白藜蘆醇+CEH siRNA組：依上述條件腹腔注射，每周2次，高脂飲食，共10周。對照組：不進行任何干預，高脂飲食10周。

3 血脂水平檢測 血液從腹主動脈收集于肝素抗凝管，離心3 000 r/min，10 min。而后血漿在-80 ℃冰箱內(nèi)保存。采用全自動生化分析儀及血生化測定試劑盒，檢測總TC、TG、HDL-C含量和LDL-C含量，所有操作步驟按儀器說明書進行。單位以mmol/L表示。

4 病理觀察 將4%多聚甲醛固定后的主動脈切成3~4 mm長度組織塊，冰凍包埋。冰凍包埋：用OCT包埋組織，錫紙包裹，放-40 ℃冰箱中備用。將包埋的組織蠟塊分別連續(xù)切片，切片厚5 μm，于60 ℃烤片機烤2 h，然后分別用于油紅O染色、HE染色，光鏡下觀察各組主動脈內(nèi)膜、中膜的病變，CMIA彩色病理圖像分析系統(tǒng)計算其厚度。

5 qRT-PCR檢測CFH及VCAM-1的表達 具體步驟參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應。反應條件如下 ：95 ℃ 15 min ；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃2 min，共30個循環(huán)。取10 μl PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。qRT-PCR法檢測CFH的表達，上游引物為：5'-GCACTTGGATCCACCCAGAA-3'，下游引物為：5'-GAAGTTGTCAAAGATGGTGCCAG A-3'。VCAM-1的表達上游引物為：5'-CTGCTCAC CCAACATTTCGT-3'，下游引物為：5'-GTGGTTTGT CCAAACTCATCAA-3'。內(nèi)參β-actin的上游引物為：5'-ACCCTGAAGTACCCCATCG-3'，下游引物為：5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。

6 Western blot檢測CFH及VCAM-1的表達 用pH 7.4 含 50 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.1% Triton X-100和0.1%十二烷基硫酸鈉的蛋白裂解液提取胸主動脈的總蛋白，蛋白濃度參照BCA試劑盒測定。煮沸變性的蛋白以每孔40 μg的含量加樣，經(jīng)濃縮膠6%，分離膠10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在37 ℃封閉2 h。分別與1∶300兔抗人CFH，1∶2 000鼠抗人VCAM-1抗體4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG(1∶500)羊抗兔IgG(1∶500)，4 ℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像。

7 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所得結果用-x±s表示，采用ANOVA分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 白藜蘆醇與CEH對ApoE-/-小鼠血脂的影響白藜蘆醇+CEH siRNA和白藜蘆醇組TC和TG均略有降低，而HDL-C略有升高；CEH siRNA組TC和TG均略有升高，而HDL-C略有降低。但與對照組相比均無統(tǒng)計學差異；白藜蘆醇組LDL-C與對照組相比下降(P＜0.05)，白藜蘆醇組LDL-C與白藜蘆醇+CEH siRNA組相比下降(P＜0.05)，而CEH siRNA組LDL-C與對照組相比升高(P＜0.05)說明白藜蘆醇可能通過CEH影響LDL-C的形成，見表1。

表1 各組間血脂各項指標比較(mmol/L,

表1 各組間血脂各項指標比較(mmol/L,

aP＜0.05，與對照組比較；bP＜0.05，與白藜蘆醇+CEH siRNA組比較

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2 主動脈內(nèi)膜厚度比較 光鏡下發(fā)現(xiàn)，對照組主動脈內(nèi)膜明顯增厚，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細胞，斑塊下中膜也呈不同程度破壞；白藜蘆醇組主動脈內(nèi)膜輕度增厚，斑塊內(nèi)僅見少量泡沫細胞，與空白對照組和白藜蘆醇+CEH siRNA組相比明顯減輕(P＜0.01)，與空白對照組和白藜蘆醇+CEH siRNA組相比中膜增厚不明顯(P＜0.01)；而CEH siRNA組內(nèi)膜增厚，泡沫細胞與空白對照組相比明顯增多(P＜0.01)，中膜增厚，與對照組相比無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 主動脈內(nèi)膜、中膜厚度比較(μm,

表2 主動脈內(nèi)膜、中膜厚度比較(μm,

aP＜0.01，與對照組比較；bP＜0.01，與白藜蘆醇+CEH siRNA組比較

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3 白藜蘆醇與CEH對VCAM-1表達的影響 qRTPCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn):白藜蘆醇組VCAM-1的表達和對照組比較降低；CEH siRNA組VCAM-1的表達與對照組比較增加。見圖1。

4 白藜蘆醇與CEH對CFH表達的影響 qRT-PCR和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)；白藜蘆醇組小鼠CFH的表達與對照組比較增強；CEH siRNA組小鼠CFH的表達與對照組比較降低。見圖2。

討 論

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性血管疾病，嚴重威脅人類健康。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CEH可以水解細胞內(nèi)膽固醇酯(cholesteryl esters，CEs)使其成為游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)，以促進膽固醇流出細胞，從而降低細胞中CEs的蓄積，保持細胞內(nèi)脂質(zhì)的穩(wěn)定，抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化[4]。有研究報道，CEH的表達水平與動脈粥樣硬化的易感性密切相關，兩者之間呈負相關[5]。

白藜蘆醇及其衍生物近年來受到廣泛重視，其抗動脈粥樣硬化作用也逐漸成為研究熱點，本實驗是在前期研究的基礎上進一步研究白藜蘆醇與CEH之間的關系。本研究采用ApoE-/-小鼠構建動物模型，我們對ApoE-/-小鼠予以高脂飼料喂養(yǎng)同時加白藜蘆醇和(或)CEH siRNA干預10周后，檢測各組小鼠的各項血脂指標，本研究結果顯示，與對照組相比，白藜蘆醇組LDL-C明顯下降，主動脈內(nèi)膜輕度增厚，斑塊內(nèi)僅見少量泡沫細胞，中膜增厚不明顯；CEH siRNA組LDL-C明顯升高，內(nèi)膜增厚，泡沫細胞明顯增多，中膜增厚明顯；TC、TG、HDL-C水平與對照組比差異無統(tǒng)計學意義。該結果說明白藜蘆醇可以通過CEH影響機體內(nèi)血脂水平，從而影響動脈粥樣斑塊的形成。

補體在AS形成過程中起著非常重要的作用。CFH是旁路途徑的抑制因子，它可與B因子競爭性結合C3，減少C3轉(zhuǎn)化酶的形成，使分解產(chǎn)物減少，從而達到降低動脈粥樣硬化斑塊形成的目的。細胞黏附是始動及加速AS發(fā)生、發(fā)展的分子基礎，其中血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)在介導單核細胞向內(nèi)皮黏附、遷移過程中起到極其重要的作用。當血管內(nèi)皮受損時，機體高表達VCAM-1，促使單核細胞及T淋巴細胞與內(nèi)皮細胞發(fā)生粘連，進而加速動脈粥樣斑塊的形成。本研究結果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇組CFH的表達明顯強于對照組，而VCAM-1的表達明顯低于對照組；CEH siRNA組CFH的表達明顯弱于對照組，但VCAM-1的表達卻明顯強于對照組。該研究結果的發(fā)現(xiàn)證明白藜蘆醇可以通過CEH影響動脈粥樣硬化相關因子的表達，進一步說明白藜蘆醇與CEH在預防動脈粥樣斑塊形成過程中存在著某種聯(lián)系。綜上，該研究結果的發(fā)現(xiàn)可能為動脈粥樣硬化斑塊防治提供新的思路。

圖1 A： Western Blot； B：qRT-PCR(aP＜0.05， 與對照組比較)

圖2 A； Western Blot結果；B：qRT-PCR結果(aP＜0.05， 與對照組比較)

1 Pervaiz S. Resveratrol： from grapevines to mammalian biology［J］.FASEB J， 2003， 17（14）： 1975-1985.

2 Sadruddin S， Arora R. Resveratrol： biologic and therapeutic implications［J］. J Cardiometab Syndr， 2009， 4（2）： 102-106.

3 Bishayee A. Cancer prevention and treatment with resveratrol： from rodent studies to clinical trials［J］. Cancer Prev Res （Phila），2009， 2（5）： 409-418.

4 Zhao B， Fisher BJ， St Clair RW， et al. Redistribution of macrophage cholesteryl ester hydrolase from cytoplasm to lipid droplets upon lipid loading［J］. J Lipid Res， 2005， 46（10）：2114-2121.

5 Rothblat GH， de la Llera-Moya M， Favari E， et al. Cellular cholesterol flux studies： methodological considerations［J］.Atherosclerosis， 2002， 163（1）：1-8.