趙 軍，晏沐陽，張傳福，劉麗霞，宋宏彬

1解放軍總醫(yī)院 心血管病研究所，北京 100853；2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 疾病預(yù)防控制所，北京 100071；3解放軍第261醫(yī)院，北京 100094

CD59是補體系統(tǒng)中重要的補體調(diào)節(jié)蛋白，在補體激活終末階段抑制攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)的形成，保護細胞免遭補體激活造成的損傷[1]。但其在腦缺血-再灌注損傷中的表達和意義并不清楚。我們通過建立小鼠腦缺血再灌注動物模型，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)法和熒光定量PCR技術(shù)，檢測腦組織中不同時間點補體調(diào)節(jié)蛋白CD59的表達變化情況，初步探討其在腦缺血-再灌注免疫損傷中的可能意義。

材料和方法

1 材料 健康雄性昆明小鼠48只，體質(zhì)量(23±3) g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分為正常組、缺血再灌注6 h、24 h、48 h、72 h、96 h，每組8只。

2 腦缺血-再灌注動物模型建立 參考Longa等[2]的方法并做適當改變，制備小鼠腦缺血再灌注動物模型。用1%戊巴比妥鈉按照50 mg/kg腹腔注射麻醉。在小鼠頸部做正中切口，長度約為1 cm，逐步分離小鼠右側(cè)頸總動脈、頸外動脈并結(jié)扎。在頸總動脈結(jié)扎部位遠心端剪口，將直徑約為0.125 cm的魚線插入，進線長度為1~1.5 cm，通過右側(cè)頸內(nèi)動脈到達右側(cè)大腦中動脈起始處。1 h后拔出，引起再灌注。

3 神經(jīng)功能缺失評分 按照Longa評分標準的5分法稍加改進進行評分：0分無神經(jīng)缺損征；1分提尾時左前肢內(nèi)收，不能完全伸直；2分行走向左傾倒；3分向左旋轉(zhuǎn)；4分不能自己行走或昏迷。1~4分為有效模型[3]。

4 腦組織損傷病理檢查 腦組織多聚甲醛固定，蔗糖脫水后行冰凍切片，厚6 μm。切片丙酮4 ℃固定30 s，后稍水洗；蘇木素染液染色3 min，1%鹽酸酒精分化10 s，水洗2 s；促藍液返藍10 s，自來水流水沖洗1 min；0.5%伊紅染液染色2 min，自來水沖洗；80%酒精、95%酒精、無水乙醇梯度脫水各1 min，二甲苯Ⅰ1 min，二甲苯Ⅱ1 min，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照。

5 熒光定量RT-PCR檢測 NReasy Mini Kit提取腦組織mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用下列引物擴增，CD59：上游 5'-TTCTgTTCCACAgCTgTTAgCC-3'，下游5'-TgATTgTTTCCAACACCTTTgA-3'，使用GAPDH作為內(nèi)參基因：上游5'-TgCCCCCATgTTTgTgATg-3'，下游5'-TgTggTCATgAgCCCTTCC-3'。

6 免疫熒光檢測 按實驗選取的時間點處死小鼠取材，腦組織多聚甲醛固定，蔗糖脫水后行冰凍切片，厚6 μm。切片置丙酮中4 ℃固定10 min；用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。封閉：10%正常羊血清溶液，37 ℃封閉1 h，甩去封閉液后加一抗 CD46(Santa Cruz Bio-technology)，1∶100(PBS稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；Cy3標記的二抗，1∶50(PBS稀釋，避光)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照，并用Image-pro plus6.1圖像分析軟件進行分析。

7 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能缺失評分 與對照組相比，小鼠神經(jīng)功能缺失評分隨缺血-再灌注時間的延長逐漸增高，至24 h達最高(P＜0.01)，至再灌注48 h(P＜0.01)時保持較高水平，72 h后逐漸恢復(fù)。見圖1。

2 腦組織損傷區(qū)組織形態(tài)學(xué)觀察 HE染色后，光鏡下觀察神經(jīng)細胞組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)正常組腦神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞核較大，細胞及間質(zhì)無水腫，伴隨再灌注時間推進，海馬區(qū)腦神經(jīng)細胞多數(shù)神經(jīng)細胞核固縮，神經(jīng)細胞壞死，伴有水腫，24 h達損傷高峰，72 h以后海馬區(qū)組織形態(tài)有所恢復(fù)。見圖2。

3 腦組織中CD59 mRNA的表達變化 與空白對照組相比，隨著缺血-再灌注時間的延長CD59 mRNA的表達量逐漸減少，24 h最低(P＜0.01)，48 h后逐漸升高(P＜0.01)。見圖3。

4 海馬區(qū)CD59蛋白的表達變化 正常對照組海馬區(qū)及周圍可見大量CD59蛋白沉積,從缺血-再灌注6 h開始，在海馬區(qū)及周圍表達量逐漸減少，24 h最低，48 h后逐漸接近正常。見圖4。

討 論

腦血管病中缺血性腦血管病占80%以上，以其高發(fā)病率、高致殘率和高病死率嚴重威脅人類生命健康，早期的溶栓治療和保護神經(jīng)是治療缺血性腦血管病的主要治療方法，但溶栓藥物有嚴重的并發(fā)癥，如出血、缺血-再灌注引起的腦水腫和病變血管再閉塞等問題[4-5]。

近年來研究證明，補體激活在腦缺血-再灌注炎癥損傷中扮演著重要角色[6-8]。補體調(diào)節(jié)蛋白CD59通過結(jié)合C8、C9，調(diào)節(jié)C5b-9復(fù)合物的形成和功能,防止攻膜復(fù)合物MAC對同種或自身細胞的溶解破壞。有研究證實，在貓ALI和ARDS模型中CD59表達下調(diào)，在人類罕見疾病如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿中，CD59的表達缺失與血栓形成風(fēng)險的增加有密切關(guān)系[9-10]。

我們通過免疫組化及熒光定量PCR的方法觀察了CD59的表達規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常小鼠腦組織中CD59大量表達，在缺血-再灌注后6 h缺血區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞胞漿中CD59表達已開始明顯減少，缺血-再灌注后24 h表達最低，持續(xù)至48 h，72 h后表達逐漸升高。比較補體調(diào)節(jié)蛋白CD59的表達變化情況與腦組織損傷的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它與腦組織損傷程度呈平行關(guān)系。表明缺血-再灌注后CD59的表達變化與腦組織損傷直接相關(guān)，是腦組織的保護因素之一。目前有研究證實，作為重要的補體調(diào)節(jié)蛋白SCR1對大鼠腦缺血再灌注損傷有確切的保護作用，下一步，可以通過檢測SCR1在小鼠腦缺血-再灌注不同時間的表達變化，與CD59的表達進行對比，進一步闡釋CD59的表達將有助于減輕腦組織損傷，從而為腦保護治療提供新的思路[11]。

圖1 腦缺血再灌注各組神經(jīng)行為學(xué)評分(n=8/組) (與正常組比較，a: P＜0.01)Fig.1 Neurological score of different ischemia-reperfusion groups(n=8)

圖2 各組腦缺血再灌注損傷區(qū)病理觀察(×10)A： 正常對照組； B：缺血-再灌注6 h組； C：缺血-再灌注24 h；D：缺血-再灌注48 h組； E：缺血-再灌注72 h組； F：缺血-再灌注96 h組Fig.2 Pathological injury in control group (A) and ischemiareperfusion groups at 6 h(B), 24 h(C), 48 h(D), 72 h(E) and 96 h(F)(×10)

圖3 腦缺血再灌注后各組CD59 mRNA的表達變化(a: P＜0.01； b: P＜0.05 vs control)Fig.3 CD59mRNA expressions in different groups after cerebral ischemia-reperfusion

圖4 各組腦缺血再灌注損傷區(qū)CD59免疫熒光表達變化(×10)A：正常對照組； B：缺血再灌注6 h組； C：缺血再灌注24 h組；D：缺血再灌注48 h組； E：缺血再灌注72 h組； F：缺血再灌注96 h組Fig.4 Immunofluorescence staining showing CD59 expression in control group (A) and ischemia-reperfusion groups at 6 h(B),24 h(C), 48 h(D), 72 h(E) and 96 h(F)(×10)

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