易金萍，陳小文，李建春，鄧瓊

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西 南昌 330006)

IL-18屬IL-1家族成員之一，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生,最初命名為IFN-γ誘導(dǎo)因子,是一種具有多效性的細(xì)胞因子。在IL-12協(xié)同作用下,IL-18誘導(dǎo)高劑量Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生。然而,IL-18也能誘導(dǎo)Th2細(xì)胞應(yīng)答。在IL-2協(xié)同作用下,誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-13,誘導(dǎo)B細(xì)胞合成IgE。因此IL-18在過敏性疾病炎癥反應(yīng)中起著重要作用。據(jù)報(bào)道IL-18基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)可影響IL-18的產(chǎn)生。本文就IL-18基因啟動子區(qū)-607C/A、-137G/C基因多態(tài)性與江西人群哮喘的關(guān)系作一報(bào)道。

1 對象與方法

1.1 對象 哮喘組(A組)為2011年1月至2012年12月住院收入的146例支氣管哮喘患者,男48例,女 98例,平均年齡(32.6±10.8)歲,均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組2003年制定的支氣管哮喘防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組(C組)為106例健康體檢者,男36例,女70例,平均年齡(31.5±10.2)歲。各組一般資料具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 采集受檢者靜脈血2ml,用EDTA-K2抗凝。采用DNA提取試劑盒按照說明書提取外周血基因組DNA,溶解于TE緩沖液,-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[1]采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)設(shè)計(jì)引物。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) -607(C/A)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增步驟為:94℃預(yù)變性2min;94℃變性20s,64℃退火40s,72℃延伸40s,7個(gè)循環(huán);94℃變性20s,57℃退火40s,72℃延伸40s,25個(gè)循環(huán)。-137(G/C)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增步驟為:94℃預(yù)變性2min;94℃變性20s,68℃作用 1min,5個(gè)循環(huán);94℃變性 20s,62℃退火20s,72℃延伸40s,25個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物80 V恒壓電泳30min,紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 基因型和等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律后,各基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSP結(jié)果 -607C/A位點(diǎn)的特異性正向引物和通用反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物為196 bp,內(nèi)參正向引物和通用反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物為301bp。-137G/C位點(diǎn)的特異性正向引物和通用反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物為261bp,內(nèi)參正向引物和通用反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物為 446 bp(圖 1)。

2.2 二組人群IL-18-607C/A、-137G/C基因多態(tài)性分析 經(jīng) χ2檢驗(yàn),各組IL-18-607C/A、-137G/C基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。各組IL-18-607C/A、-137G/C基因型及等位基因頻率分布見表1~3，各組之間均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 IL-18基因啟動子-607C/A、-137G/C位點(diǎn)多態(tài)性電泳圖

表1 各組IL-18-607C/A基因型和等位基因頻率的比較

表2 各組IL-18-137G/C基因型和等位基因頻率的比較

表3 各組IL-18-607C/A、-137G/C基因多態(tài)性單倍型比較

3 討論

哮喘是一種以可逆性的支氣管收縮、氣道高反應(yīng)性和炎癥為特征的慢性呼吸道疾病。Th2細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在氣道炎癥形成中起著關(guān)鍵作用。IL-18在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用依賴于不同的細(xì)胞因子環(huán)境。IL-18能和IL-12協(xié)同作用誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，刺激Th1型免疫應(yīng)答而抑制IgE的合成[2，3]。許多研究也證實(shí)了IL-18參與哮喘發(fā)病機(jī)制。Tanaka等[4]報(bào)道IL-18濃度在急性哮喘患者中升高，治療后IL-18濃度很快下降，并且和最大呼氣流速成反比，表明IL-18在哮喘急性期可能反映疾病的嚴(yán)重程度。

IL-18基因啟動子區(qū)SNP可影響IL-18的產(chǎn)生。-607C/A位于cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)的結(jié)合位點(diǎn),-137G/C位于GATA3結(jié)合位點(diǎn)。-607 C變?yōu)锳和-137 G變?yōu)镃影響轉(zhuǎn)錄因子與IL-18基因啟動子的結(jié)合能力,阻斷IL-18的基因轉(zhuǎn)錄從而影響IL-18表達(dá)。近來有諸多IL-18基因SNP與哮喘關(guān)系的研究報(bào)道。IL-18基因啟動子-607C/A、-137G/C SNPs與外國人群哮喘的相關(guān)性有較多的報(bào)道，與中國人群哮喘的相關(guān)性報(bào)道較少。Pawlik等[5]證實(shí)-137G等位基因和CG/GG基因型與波蘭人群重度哮喘的發(fā)病有關(guān)。Niti等[6]報(bào)道攜帶-137CC基因型降低哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。而Lachheb[7]認(rèn)為IL-18-607A等位基因和突尼斯人特應(yīng)性哮喘相關(guān)。Ma等[8]對 6 例-607C/A、-137G/C SNPs與哮喘的易感性的報(bào)道進(jìn)行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)攜帶-607AC/CC基因型與增加哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性。楊慧等[9]未檢出-607C/A、-137G/C和過敏性哮喘有關(guān),而認(rèn)為-137C等位基因與合并過敏性鼻炎的哮喘有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)-607C/A、-137G/C等位基因頻率在對照組與哮喘組非常接近，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述報(bào)道結(jié)果的不一致性可能與人種差異、入選病例標(biāo)準(zhǔn)、病例數(shù)量、病例分層和統(tǒng)計(jì)處理等多種因素有關(guān)。

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