程闊菊，黃 河，杜智勇，李 洪，楊天德

（第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院麻醉科，重慶 400037）

各種基因敲除及轉基因小鼠已廣泛應用于心血管疾病動物模型的建立，已為心血管疾病機制的研究作出了巨大貢獻。體外心肌細胞培養(yǎng)作為一種體外實驗研究模型，可以排除神經(jīng)、體液的干擾而獨立地從細胞和分子水平研究心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展機制，但由于小鼠心肌細胞的分離和培養(yǎng)比較困難，所以一直限制了醫(yī)學科研工作者在細胞生物學水平上對心血管疾病方面的深入研究。本實驗室在以往的經(jīng)驗基礎上，摸索出了一套成熟可行、簡單可靠的小鼠心肌細胞培養(yǎng)方法，獲得的心肌細胞存活率高且純度高。本文對此培養(yǎng)方法做一簡單介紹，并對其中的關鍵影響因素做詳細的探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 1～3d齡野生型C57新生乳鼠，SPF級，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（渝）2007－0003。

1.1.2 主要儀器與試劑 顯微眼用鑷、眼科剪、顯微鑷、顯微剪（上海醫(yī)療器械有限公司），器械使用前清洗干凈并經(jīng)高壓滅菌（121℃，20min）。二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡（OLYMPUS）、超凈工作臺（蘇凈安泰）、低溫臺式離心機（Sigma）。小牛血清、DMEM／F12、胰酶、膠原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脫氧尿苷（Sigma），青霉素、鏈霉素（華美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），組織固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞培養(yǎng)方法 乳鼠75%乙醇全身消毒，眼科剪沿劍突處正中線開胸，輕輕擠出心臟，迅速用彎顯微鑷取下心臟，放入盛有冷DMEM／F12培養(yǎng)液的平皿中。用眼科剪剪掉兩心耳，輕柔清洗殘留血液后心臟轉入另一盛有冷DMEM／F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，將心臟均勻剪成約1mm3的碎片。將心臟脆片組織轉入無菌離心管中，加入約10倍體積的消化液（胰酶0.125%，膠原酶Ⅱ0.125%），將離心管放入37℃溫水中，不時振蕩以保持心肌碎片始終處于懸浮狀態(tài)。首次消化10min，自然沉降，棄上清液。再加約10倍沉淀體積的消化液繼續(xù)消化15min（不時振蕩以保持心肌碎片始終處于懸浮狀態(tài)，后同），自然沉降，吸取上清液轉移至另一離心管，加1倍體積含20%血清的完全培養(yǎng)液終止消化。剩下的心肌碎片補加消化液直至消化完全。合并上清液，400g離心8min，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)基，輕柔吹打重懸細胞。將細胞懸液經(jīng)40 μm細胞過濾網(wǎng)過濾，以濾去細胞團塊，將細胞接種于100mm培養(yǎng)皿中進行差時貼壁90min，以除去心肌成纖維細胞和血管細胞等非心肌細胞。輕輕吸出上清液，40μm濾網(wǎng)過濾，加入溴脫氧尿苷（BrdU），使其培養(yǎng)液終濃度為0.1mmol／L，輕柔混勻之后，種植到包被好明膠的6孔板中。37℃5%CO2孵育48h后用無血清DMEM／F12清洗1次，更換完全培養(yǎng)液，以后每隔24h更換1次完全培養(yǎng)液，完全培養(yǎng)液含0.1mmol／L BrdU終濃度。

1.2.2 心肌細胞存活率測定 心肌細胞差時貼壁后接種前，吸取100mL細胞懸液與100mL臺盼藍染色液均勻混合，染色3min后吸取少量經(jīng)染色的細胞混合液，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，至少數(shù)500個細胞，數(shù)出藍色細胞和細胞的總數(shù)，藍色細胞為死亡細胞，未著色細胞為活細胞，計算細胞存活率。細胞存活率＝（細胞總數(shù)－藍色細胞數(shù)）／細胞總數(shù)×100%。

1.2.3 心肌細胞形態(tài)學觀察 心肌細胞接種于35mm小皿中培養(yǎng)貼壁后，倒置顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)并拍照。

1.2.4 心肌細胞純度鑒定（α－actin染色） 心肌細胞接種于35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。貼壁后，吸去培養(yǎng)液，PBS液輕柔漂洗細胞爬片后于CO2培養(yǎng)箱中孵育45min。取出，棄去PBS液，加組織固定液室溫固定12min。吸去固定液，加PBS液輕柔漂洗5min×3次。棄PBS液，0.2%Triton X－100室溫打孔通透5min，吸去通透液，加PBS液漂洗5min×3次。5%羊血清室溫封閉2h，吸去封閉液，滴加1∶100稀釋（稀釋液1%羊血清）的rat anti－mouseα－actin抗體，用封口膜蓋好，4℃過夜。取下封口膜，用自制針頭小鉤取出細胞爬片，PBS液漂洗5min×6次，滴加二抗（goat anti－rat IgG，按1∶200稀釋），封口膜蓋好，37℃避光孵育1.5h。取下封口膜，吸去二抗，PBS液漂洗5min×4次，取出爬片，蒸餾水漂洗，DAPI封片。熒光鏡下觀察，拍照，免疫熒光染色陽性者為心肌細胞，同一視野下普通光下觀察、拍照、計數(shù)肌細胞總數(shù)，計算心肌細胞純度。

2 結 果

2.1 細胞存活率測定 臺盼藍染色觀察顯示細胞存活率達95%以上。

圖1 培養(yǎng)3d的心肌細胞

圖2 心肌細胞的anti－α－actin染色鑒定

2.2 心肌細胞形態(tài)學觀察 心肌細胞未貼壁懸浮于培養(yǎng)液中時形狀為橢圓形或圓形。1d左右，心肌細胞開始長出偽足；2d左右，偽足在鏡下成纖維條索狀，此時心肌細胞則已完全貼壁，細胞胞體呈不規(guī)則形狀，如梭形、菱形或多角形，細胞開始聚集生長（圖1）。3d左右出現(xiàn)同步自發(fā)性搏動，每分鐘約100次。

2.3 心肌細胞純度鑒定 心肌細胞anti－α－actin染色呈陽性（圖2），可見明顯的心肌特異性橫紋肌結構，細胞核周圍可見棕黃色顆粒，心肌細胞陽性率大于95%。

3 討 論

鼠心肌細胞培養(yǎng)包括大鼠心肌細胞培養(yǎng)和小鼠心肌細胞培養(yǎng)，大鼠心肌細胞培養(yǎng)技術已相對成熟，已廣泛應用于心血管疾病的研究，而小鼠心肌細胞的培養(yǎng)技術則難度較大，目前應用受限。小鼠心肌細胞的培養(yǎng)又包括成年小鼠和乳小鼠心肌細胞的培養(yǎng)，由于成年小鼠心肌細胞已失去增殖分化能力，培養(yǎng)難度則更大，在此文中僅討論乳小鼠的心肌細胞培養(yǎng)技術。心肌細胞在培養(yǎng)過程中易受各種處理因素和操作水平的影響，其存活率、搏動效果和純度均是影響后續(xù)實驗的主要因素，也是該技術的瓶頸問題。因此，本文對心肌細胞培養(yǎng)過程中影響心肌細胞存活率、搏動效果和純度的影響因素進行重點討論。

3.1 鼠齡選擇 小鼠心肌細胞隨年齡的增長，其增殖分化能力逐漸減弱，新生3d內，尚具有部分增殖分化能力［1－2］，而成年小鼠心肌細胞則不具備增殖能力成為終末分化細胞。因此，在選擇鼠齡時，應盡量選擇1～3d鼠齡的乳鼠，這樣的心肌細胞成活率及貼壁率較高。根據(jù)作者的經(jīng)驗，半日齡內乳鼠最為理想。

3.2 心肌細胞消化 消化過程是影響心肌細胞存活率的重要因素，其主要影響因素有消化酶、消化溫度和振蕩力度。用于心肌細胞消化的酶主要有胰酶和膠原酶，胰酶不僅可分解組織間質蛋白成分，同時對肌細胞膜蛋白亦起較強的破壞作用［3－4］，因此，對心肌細胞損傷較大，但消化徹底。膠原酶主要作用于細胞間質的膠原纖維［5］，故作用緩和，對細胞損傷也較小，但消化時間長且不徹底。本實驗室的經(jīng)驗為胰酶聯(lián)合膠原酶同時使用，以降低胰酶對細胞的損傷，同時又不影響心肌細胞的徹底消化。不同濃度配比的胰酶和膠原酶混合消化液對心肌細胞的作用時間也是有影響的。本實驗室應用的胰酶和膠原酶的比例為1∶1（0.125%∶0.125%），消化溫度為36.5℃～37℃，振蕩頻率及力度以達到使心肌碎片處于均勻懸浮狀態(tài)即可，除首次消化外每次消化15min。首次消化下來的細胞主要為一些血細胞和從組織邊緣消化下來的壞死心肌細胞及其細胞碎屑，應棄去。使心肌碎片始終處于懸浮狀態(tài)是為了保證心肌碎片與消化液充分接觸，達到同步消化。小鼠心肌細胞比較脆弱，振蕩力度不宜過大且建議不使用攪拌子進行攪拌消化。

3.3 防止污染 防止細胞污染是心肌細胞成功培養(yǎng)的另一重要因素。細胞培養(yǎng)過程中污染來源主要有以下幾條途徑：（1）不潔的動物組織標本：取材時動物消毒不徹底或操作不小心導致心臟組織污染；（2）清洗消毒：培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，引入微生物和有毒物質；（3）操作：操作者未戴口罩、帽子，或操作不當心、操作不規(guī)范將無菌器具碰到了污染的物品；（4）空氣：空氣中含有大量的微生物也是導致細胞污染的主要原因，常見的有細菌、真菌、支原體等；（5）血清：市售血清滅菌不徹底，潛在病毒和支原體污染。

3.4 細胞純化 心臟組織消化下來的細胞主要包括心肌細胞（約80%）和成纖維細胞，另外有少部分血管細胞等［6］。盡管成纖維細胞在數(shù)量上不及心肌細胞，但成纖維細胞具有增殖分化能力，生長迅速，且貼壁較心肌細胞早，若不加以控制，則會生長成為優(yōu)勢細胞，嚴重影響心肌細胞的純度和生長狀態(tài)。在此，可以利用成纖維細胞較心肌細胞貼壁早的特點，在培養(yǎng)60～90min時，大部分成纖維細胞已貼壁而心肌細胞尚未貼壁。采用差速貼壁的方法可除去大部分成纖維細胞。差速貼壁剩下的少量成纖維細胞可通過在培養(yǎng)基中加入溴脫氧尿苷（BrdU）以抑制成纖維細胞的DNA和蛋白質合成［7］加以控制。本實驗室經(jīng)過差速貼壁和BrdU處理后，心肌細胞的純度一般可達95%以上，完全可用于后續(xù)試驗。另外，小鼠心肌細胞比較脆弱，在各操作步驟中若時間與力度控制不是很準確時，則會遇到心肌細胞貼壁不好的情況。根據(jù)作者的經(jīng)驗，此時可用1%明膠包被培養(yǎng)皿則可良好貼壁。

3.5 接種密度 心肌細胞接種密度不僅可影響細胞間的相互接觸，并且會影響細胞長期培養(yǎng)的成活率［8］。接種細胞的密度應根據(jù)實驗觀測目的而定。一般而言，若需單個心肌細胞貼壁生長，如作形態(tài)學觀測，6孔板中每孔的接種細胞數(shù)量應控制在（1～2）×105個；若需心肌細胞形成單層細胞或多層細胞，或形成細胞簇，如收獲心肌細胞作mRNA或蛋白表達水平的觀測時，則每孔的接種密度可增加到（5～6）×105個。

3.6 其他 其他影響因素包括培養(yǎng)液的pH值，pH值為7.0～7.2時更利于細胞的生長［9］，且培養(yǎng)液隨著放置時間的延長pH值逐漸升高，因此，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。若操作技術嫻熟，培養(yǎng)液里可不加抗菌藥物。本實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液里不加抗菌藥物時，心肌細胞生長狀態(tài)更為良好；換液時間太短或太長均不利于心肌細胞生長，以肉眼可見培養(yǎng)液顏色改變即pH值改變時換液即可。

4 結 語

小鼠心肌細胞在培養(yǎng)技術上還存在著一定的難度，如何簡化分離、純化步驟、提高心肌細胞存活率和純度仍是小鼠心肌細胞培養(yǎng)技術的關鍵。隨著各種基因敲除和轉基因小鼠在心血管疾病機制研究中的廣泛應用，相信與之相對應的小鼠心肌細胞體外模型會將心血管疾病的機制研究在細胞和分子水平上推向一個新的高度。

［1］ Brand NJ，Lara－Pezzi E，Rosenthal N，et al.Analysis of cardiac myocyte biology in transgenic mice：aprotocol for preparation of neonatal mouse cardiac myocyte cultures［J］.Methods Mol Biol，2010，633：113－124.

［2］ Jones BW，Brunet S，Gilbert ML，et al.Cardiomyocytes from AKAP7knockout mice respond normally to adrenergic stimulation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（42）：17099.

［3］ Sreejita P，Kumara S，Vermaa RS，et al.An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice［J］.In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology Animal，2008，44（3＆4）：45.

［4］ Liao R，Jain M.Isolation，culture，and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes［J］.Methods Mol Med，2007，139：251－262.

［5］ Wyatt KE，Bourne JW，Torzilli PA.Deformation－dependent enzyme mechanokinetic cleavage of type I collagen［J］.J Biomech Eng，2009，131（5）：051004.

［6］ 陽海鷹，丁巍，丁愛石，等.新生小鼠心肌細胞培養(yǎng)模型的建立及其在毒性評價研究中的應用［J］.軍事醫(yī)學科學院院刊，2010，34（1）：30－33.

［7］ 李琳，龍超良，汪海.埃他卡林對心肌細胞損傷保護作用的藥理學特征［J］.中國藥理學通報，2011，27（4）：497－500.

［8］ Gissel C，Doss MX，Altenburg RH，et al.Generation and characterization of cardiomyocytes under serum－free conditions［J］.Methods Mol Biol，2006，330：191－219.

［9］ Bers DM，Barry WH，Despa S.Intracellular Na＋regulation in cardiac myocytes［J］.Cardiovasc Res，2003，57（4）：897－912.